Денситометрия расшифровка: Денситометрия в СПб

Содержание

Денситометрия — garmonya.by

Услуга

Цена, BYN

Ультразвуковая денситометрия (г. Жодино)

46,03

Актуальная проблема со здоровьем современных людей — остеопороз — может появиться в нашей жизни по ряду причин:

• в результате наследственных нарушений процессов костного образования;
• гормональных возрастных изменений;
• при ревматоидном артрите, остеомиелите и других заболеваниях;
• при приёме определённых лекарственных препаратов;
• неправильном питании.
Всё это приводит к нехватке в организме трёх главных веществ, от которых зависит здоровье костей:
Кальций – минерал, который делает их твердыми.
Магний – это вещество помогает кальцию усваиваться и удерживаться в организме, защищает пожилых людей от вымывания кальция и наступления остеопороза.
Витамин D – необходим для регенерации костей и мышечной массы. Его недостаток связан с развитием остеопороза – состояния, при котором костная ткань становится менее плотной и более хрупкой. Это и повышает риск переломов.

Разрушение костей, к сожалению, никак не проявляется на самочувствии человека, лишь после травмы возникают тяжёлые последствия в виде долгого восстановления. Чтобы не рисковать своим здоровьем, важно заранее провести диагностику остеопороза.
Обычная рентгенография не выявляет нарушения на ранней стадии, в отличие от денситометрии — исследования, которое проводится на современном высокотехнологичном оборудовании.

Преимущества денситометрии:
• отображает минеральную плотность и эластичность костной ткани;
• позволяет судить о порозности костных структур;
• можно оценить механические свойства кости, то есть нагрузку, которую они могут вынести.
Главный плюс — исследование не требует никакого проникновения в кость и забора материала.

Кому показана денситометрия:
• женщинам, y которых наступила менопауза;

• пожилым людям c жалобами на ноющие боли в спине;
• людям c быстро прогрессирующими изменениями осанки;
• при частых, необъяснимых переломах;
• пациентам, находящимся в группе риска, исследование плотности костей показано раз в два года.
В нашем центре Вы можете проверить здоровье вашей костной системы с помощью ультразвукового денситометра компании BeamMed (Израиль). Методика основана на регистрации изменений характеристик ультразвуковой волны при прохождении ее через кость.
Доказано, что данные УЗ денситометрии имеют четкую корреляцию с риском переломов и соответствуют данным других методов денситометрии. Она многофункциональна и безопасна.

Пройти денситометрию можно в филиале медцентра в Борисове
Короткий номер 159
+375 (29) 773-60-00, +375(177) 78-40-00.

Прием ведут:

Специальность: Врач: акушер-гинеколог, врач ультразвуковой диагностики.

Направление: Гинекология, УЗИ диагностика
Категория: Высшая
Опыт работы: Более 20 лет
Город: Борисов / Жодино

Записаться к врачу

Вас также может заинтересовать

РКТ грудной клетки – увидеть болезнь в зародыше

Современные методики диагностирования с помощью цифровой томографии – это огромный прорыв для медицины. Множество серьезных заболеваний, особенно онкологических, крайне важно «поймать» в самом их начале, когда лечение может быть действительно эффективным. К тому же рентгеновская компьютерная томография позволяет следить за воздействием на организм лечения и профилактических мер, отслеживать распространение болезни, ее развитие.

РКТ позволяет визуализировать множество органов, которые находятся в нашей грудной клетке. На сделанных с помощью РКТ грудной клетки снимках, можно увидеть тонкие структуры, из которых состоит легочная ткань, а так же рассмотреть плевру и средостения. Это позволяет сделать выявление патологических процессов более ранним и точным, что повлияло на рост числа исследований с помощью рентгеновской компьютерной томографии. РКТ это кроме всего прочего – тонкие срезы исследуемых органов, располагающихся в грудной клетке и сжатые сроки исследования, не превышающие двадцати секунд. Кроме того, компьютерная обработка полученной в таких условиях информации позволяет убирать связанные с дыханием и передаточной информацией артефакты изображения.

Еще больше улучшить изображение РКТ грудной клетки помогает возможность контрастного усиления, которой снабжены аппараты последних поколений.

Для прохождения РКТ органов грудной клетки существуют такие показания, как:

отсутствие при обычной рентгенографии патологических изменений тканей, в случае, когда существуют подтверждающие их клинико-лабораторные данные;
изучение макроструктуры легких при протекании хронических процессов;
плевральные наслоения и опухоли;
спонтанный пневмоторакс, чью этиологию не удается выяснить и т.д.

Процедура РКТ проводится в томографическом центре «Аперто диагностик» уже не первый год. Это одно из основных направлений деятельности нашего центра.

Диагностика центров современной медицины Доверие+

Ультразвуковой метод диагностики — это способ получения медицинского изображения на основе регистрации и компьютерного анализа отраженных от биологических структур ультразвуковых волн, т. е. на основе эффекта эха: сначала ультразвуковой датчик подаёт сигнал, а потом органы и ткани отражают его и отправляют назад. Результаты этого процесса визуализируются на мониторе. Метод нередко называют эхографией. УЗИ является самым простым диагностическим методом в медицине, не имеющим как таковых противопоказаний для проведения.

В нашем центре Вы сможете пройти УЗИ следующих органов и систем:

-щитовидной железы
-органов брюшной полости (печень, желчный пузырь с протоками, поджелудочная железа, селезенка)

-органов мочевыделительной системы (почки, надпочечники, мочевой пузырь)
-органов малого таза (яичники и придатки)
-предстательной железы (как поверхностоной, так и трансректальной методикой)
-органов мошонки (яички, придатки)
-молочных желез
-мягких тканей
-суставов
-сосудов
-сердца
-УЗ-мониторинг овуляции
-УЗ-определение беременности с установлением срока
-УЗИ плода при беременности на различных сроках
-УЗИ лимфатических желез
-УЗИ слюнных желез.

Ультразвуковая денситометрия — метод определения минеральной плотности костной ткани, применяемый для измерения в ней содержания кальция — основного структурного элемента кости. То есть оценивается прочность костей — их плотность, микроструктура, эластичность, толщина кортикального слоя.

Данное обследование может проводиться повторно, без ограничения, т.к. отсутствует лучевая нагрузка, характерная для рентгенологического денситометра. Это позволяет точно и достоверно определить состояние костей, а также дать соответствующие рекомендации, в т.ч. беременным женщинам. Процедура безболезненна, не требует подготовки, длится 15 минут.

Ультразвуковая денситометрия — очень важный и нужный метод диагностики, поскольку проблема заболеваний костей весьма распространена и остра.

Показания для денситометрии:

Всем женщинам в пре — и постменопаузе, т.к. происходящие в этот период изменения уровня половых гормонов приводят к значительной потере кальция
Беременным женщинам
Мужчинам с риском развития остепороза
Людям с заболеваниями, сопровождающимися изменениями в костной ткани:
— почечная остеодистрофия;
— патология эндокринных органов;
— ювенильный остеопороз;
— Прежде всего, денситометрию необходимо проводить людям с ревматологическими заболеваниями: анкилозирующий артрит (Болезнь Бехтерева), геморрагический васкулит, псориатический артрит, хроническая ревматическая болезнь сердца (ХРБС), ревматоидный артрит, узловатая эритема, урогенный артрит, остеоартроз, остеопороз.
— Людям с хроническими заболеваниями внутренних органов: заболевания печени, желудочно-кишечного тракта, подагра, подагрическая нефропатия, туберкулёз, опухоли.
— Локальные процессы: переломы, остеомиелит.

Остеопороз занимает четвёртое место в мире по «популярности» после сердечно-сосудистых, онкологических заболеваний и сахарного диабета. Это заболевание, при котором кости теряют свою крепость и надёжность и могут сломаться даже при небольшой нагрузке или ударе. Восстановление костной ткани происходит очень медленно, и последствия таких переломов могут быть самыми разными — инвалидность, полное изменение привычного образа жизни в угоду болезни и даже летальный исход.

При этом исследования подтверждают, что остеопороз — болезнь скорее женская: женщины «бальзаковского возраста» и старше подвержены ей в несколько раз чаще, чем мужчины той же возрастной группы.

Выделяют первичный и вторичный остеопороз. Наиболее распространён первичный, который бывает постменопаузальным (развивается после полного прекращения месячных) или сенильным (возникает после 65-70 лет), и составляет 85% всех случаев остеопороза.

Вначале процесс «потери кальция» приводит к остеопении, т.е. снижению плотности кости, что человек субъективно может не ощущать. Если не предпринимаются меры по восстановлению плотности кости, то процесс переходит в остеопороз.

К счастью, остеопороз, в отличие от сахарного диабета, например, лечить намного легче. Ранняя денситометрия увеличит ваши шансы на долгую, активную и полноценную жизнь.

Врач: Незлобина Елена Александровна

Дерматоскопия — диагностика новообразований кожи, ранняя диагностика меланомы. Данный метод является стандартом диагностики новообразований в развитых странах и проводится перед удалением кожных новообразований (родинки, папилломы, бородавки, кератомы). После дерматоскопии в нашей клинике возможно удаление образований методом электрокоагуляции, криодеструкции или хирургическим путем.

Кому и когда необходимо проведение дерматоскопии:

·Перед удалением любого кожного образования.

·Людям со светлой кожей и светлыми волосами.

·Если размер родинки превышает 0,5 см.

·Людям пожилого возраста (от 60 лет).

·Людям, имеющим родимые пятна, особенно более 10 см в диаметре.

·Люди с наследственной отягощенностью (меланома, базалиома у родственников).

·Если родинка увеличилась, уплотнилась, изменила окраску в цвете, приобрела неравномерную окраску.

·Если в родинке появилось воспаление, шелушение, изъязвление, зуд, покалывание.

Врач: Родионова Славяна Александровна

В нашем центре используют разнообразные методы функциональной диагностики для получения точной и достоверной информации о состоянии пациента. Они обладают высокой информативностью и точностью, и представляют существенную ценность для врача-клинициста. Методы функциональной диагностики безопасны, поэтому их можно использовать не один раз.

Электрокардиография (или ЭКГ) – это неинвазивный метод оценки работы сердца. Пациент ложится на кушетку, к грудной клетке, рукам и ногам подсоединяют специальные электроды, которые регистрируют электрическую активность сердца. После проведения обследования врач получает кардиограмму, которую расшифровывает и определяет, насколько регулярны сердечные сокращения, есть ли нарушения кровообращения и т.д. На руки пациент сразу после обследования получает ленту ЭКГ и расшифровку ее показателей.

Врачи:

Лопухов Д.В.

Кудряшова Н.В.

Тарахтиева Е.С.

Якушина М.С.

Солонина М.С.

Холтеровское суточное мониторирование ЭКГ (или Холтер) – это мониторинг ЭКГ в течение 24 часов на портативный регистратор. На тело пациента крепятся электроды, портативный регистратор помещается в нательную сумку, прибор в течение 24 часов производит регистрацию ЭКГ. В этот период пациент ведет дневник физической нагрузки, эмоциональных перенапряжений и прочих факторов, проводит функциональные пробы. На следующий день регистратор снимается, проводится расшифровка суточной ЭКГ, по готовности бланка расшифровки Вам звонят администраторы центра, приглашая за результатом. Этот метод позволяет выявить не только нарушения ритма и ишемические нарушения, но и контролировать антиаритмическую и антиангиальную терапию.

Врач: Солонина М.С.

Ранняя биохимическая диагностика остеопороза

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Остеопороз метаболическое заболевание скелета, протекающее длительно и поражающее значительную часть населения, особенно, старших возрастных групп. Помимо заболеваний сердца, инсульта, диабета и онкологических заболеваний, остеопороз одно из наиболее важных, с которыми приходится сталкиваться в клинической практике. Наиболее полная статистика по этой проблеме собрана в США. Ежегодно фиксируется 1,5 млн. переломов, связанных с остеопорозом, из них 700 тыс. переломов позвоночника, 250 тыс. переломов шейки бедра, 250 тыс. переломов дистального отдела лучевой кости и 300 тыс. переломов в других частях скелета. Риск переломов позвоночника, шейки бедра и дистального отдела лучевой кости составляет 40% для белых женщин и 15% для белых мужчин в возрасте 50 лет и старше. До 50% больных с переломом шейки бедра не могут обходиться без посторонней помощи, а от 15 до 20% больных умирают в течении 1-го года. Количество остеопоретических переломов в мире увеличивается и с 1,7 млн. в 1990 г. возрастёт до 6,3 млн. в 2050 г.
В связи с этим остеопороз становится важной социально-экономической проблемой. По мнению ряда исследователей, это заболевание, особенно в развитых странах, приобрело характер «безмолвной эпидемии». В России эта проблема изучается в нескольких научных центрах, несколькими научными группами. Проблема исследуется в сфере гинекологии, травматологии, эндокринологии, ревматологии, нефрологии. Литературы по этой теме на русском языке пока крайне мало, и клинические вопросы пока мало изучены.
Данное заболевание характеризуется прогрессирующим снижением костной массы в единице объёма кости по отношению к нормальному показателю у лиц соответствующего пола и возраста, нарушением микроархетектоники костной ткани, приводящим к повышенной хрупкости костей и увеличению риска их переломов от минимальной травмы и даже без таковой. В кости постоянно идут процессы костеообразования и костеразрушения, которые тесно сопряжены между собой по времени и месту происходящих событий, что определяет понятие единицы ремоделирования кости. Снижение костной массы является результатом рассогласования процессов резорбции и формирования костной ткани, которые в норме должны быть сбалансированы.
Гормональные факторы патогенеза остеопороза

Витамин D и его активные метаболиты являются компонентами гормональной системы, регулирующей фосфорно-кальциевый обмен, и участвуют, с одной стороны, в минерализации костной ткани, с другой — в поддержании гомеостаза кальция. Биологическое действие активных метаболитов витамина D заключается, главным образом, в стимуляции кишечной абсорбции кальция и фосфора, активации обмена и усилении экскреции кальция с мочой.

Глюкокортикоиды. На остеобластах находятся цитоплазматические глюкокортикоидные рецепторы опосредующие прямое действие ГК на кость.
Тироксин оказывает прямое воздействие на образование хряща во взаимодействии с ИРФ-1.
Эстрогены играют важную роль в формировании скелета и в предотвращении потерь костной массы. Они предотвращают резорбцию костной ткани путём подавления активности остеокластов.
Андрогены играют важную роль в костном метаболизме как у женщин, так и мужчин. Механизм действия андрогенов на костную ткань не вполне ясен. Однако известно, что их влияние на другие ткани-мишени опосредовано ростовыми факторами.
Соматотропный гормон. Действие СТГ связано с продукцией в костной ткани таких местных факторов как ИРФ-1, трансформирующий ростовой фактор в костный морфогенетический белок и другие. СТГ оказывает стимулирующий эффект на пролифирацию хондроцитов внутри ростовой пластинки.
Инсулин стимулирует синтез костного матрикса и образование хряща.
Большое значение для ремоделирования костной ткани имеют простагландины и цитокины. Среди простогландинов важнейший простогландин Е2.
Первоначальный, но временный эффект ПГЕ₂ ингибирование активности остеокластов. Среди системных гормонов стимулирующее действие на ПГЕ₂ оказывает ПТГ, а ГК являются ингибиторами скелетного ПГЕ₂.

Методы измерения костной ткани

Для клиницистов важно, чтобы измерения предоставляли информацию, с помощью которой можно помочь пациентам (например, сократить количество переломов). За последние несколько десятилетий было разработано много методов, позволяющих с высокой степенью точности измерять костную массу количественно в различных участках скелета (фотонная или рентгеновская денситометрия, компьютерная томография, абсорциометрия).

Полезную информацию об обмене костной ткани позволяют получить некоторые инвазивные методы. Гистоморфологический анализ гребня подвздошной кости, даёт возможность получить сведения о скорости образования костной ткани на клеточном и тканевом уровне, однако информации о величине костной резорбции недостаточно. Кроме того, исследование обмена костной ткани ограничивается небольшой областью губчатого вещества и внутренней поверхностью кортикального слоя, что не всегда отражает происходящее в других отделах скелета.

Недостатки денситометрии

Диагностика остеопороза возможна только при частичной потере костной массы.

Не позволяет прогнозировать уровень потери костной массы.

Оценка изменения плотности костной ткани возможна только через 1,5 — 2 года после назначения терапии.

Отсутствие возможности быстрой коррекции терапии остеопороза.

Скорость образования или разрушения матрикса костной ткани может оцениваться либо при измерении активности специфических ферментов костеобразующих или костеразрушающих клеток, таких как щёлочная и кислая фосфатаза, либо путём определения компонентов поступающих в кровоток во время синтеза или резорбции кости. Хотя эти показатели разделяются на маркёры синтеза и резорбции кости, следует учитывать, что в патологических условиях, когда процессы перестройки костной ткани сопряжены и изменены в одном направлении, любой из указанных маркёров будет отражать суммарную скорость метаболизма кости. Биохимические маркёры невозможно разделить в зависимости от изменений обмена в разных отделах костей, т. е. в губчатом или компактном веществе. Они отражают итоговые изменения резорбции и костеобразования, направленные в ту или иную сторону. Можно предполагать, что преобладание резорбции костной ткани над её синтезом, устанавливаемое при сравнении значений какого-нибудь маркёра резорбции и маркёра костеобразования будет в действительности соответствовать такому дисбалансу.

Биохимические маркёры ремоделирования кости

Щёлочная фосфатаза костного происхождения содержится в мембране остеобластов. В качестве показателя ремоделирования чаще всего используется общая активность щёлочной фосфатазы в сыворотке, но этому показателю свойственна низкая чувствительность и специфичность. Так как причины существенного повышения сывороточного уровня щёлочной фосфатазы могут быть различными. Например, у пожилых пациентов это может быть следствием дефекта минерализации костной ткани или влиянием одного из многих лекарственных препаратов, которым свойственно повышать активность печеночного изофермента.
Остеокальцин, также называемый костным gla-протеином, синтезируется преимущественно остеобластами и включается во внеклеточный матрикс костной ткани. Часть этого белка проникает в кровоток, где может измеряться иммунными методами.
Установлено, что при большинстве состояний, характеризующихся сопряженностью резорбции и синтеза костной ткани, остеокальцин может считаться адекватным маркёром скорости ремоделирования кости, а в тех ситуациях, когда резорбция и синтез костной ткани разобщены — специфическим маркёром костеобразования.
Биохимические маркёры костной резорбции

Определение натощак кальция в утренней порции мочи (соотнесенного с экскрецией креатинина), является самым дешёвым методом оценки резорбции кости. Этот метод полезен для определения значительно усиленной резорбции, малочувствителен.

Деоксипиридонолин (ДПИД) является перекрёстной пиридиновой связью, присущей зрелому коллагену и не подвергающейся дальнейшим метаболическим превращениям. Он выводится с мочой в свободной форме (около 40%) и в связанном с пептидами виде (60%). Определение Дпид в моче имеет ряд преимуществ.

Дезоксипиридинолин в моче (ДПИД)

Исследование ДПИД в моче применяют для оценки скорости деградации коллагена костной ткани, для контроля эффективности антирезорбтивной терапии.

Это:

высокая специфичность для обмена костной ткани;
отсутствие метаболических превращений до выведения с мочой;
возможность проводить исследования без предварительных диетических ограничений.

Значение биохимических маркёров для диагностики и мониторирования терапии остеопороза

Проведённые наблюдения за терапией основными видами групп препаратов, позволили сделать следующие выводы:

повышение уровня щёлочной фосфатазы и остеокальцина в сыворотке крови часто отмечается при лечении пациентов с остеопорозом фторидами. Определение этих маркёров рекомендовано для контроля за стимулирующим воздействием фторидов на костеобразование;
антирезорбционные препараты, такие как эстрогены и бифосфонаты, приводят при остеопорозе, который развился после менопаузы, к значительному снижению концентрации маркёров резорбции и синтеза костной ткани, вплоть до пременопазуального уровня.

Такая динамика биохимических маркёров соответствовала замедлению потери костной ткани, установленному с помощью остеоденситометрии к 9 мес. лечения.
Основная цель применения биохимических маркёров состоит в оценке костного метаболизма, что особенно важно для терапии, так как пациенты с остеопорозом и высоким уровнем метаболизма кости лучше реагируют на такие активные антирезорбтивные препараты, как эстрогены и кальцитонин. В том случае, если показатели костного метаболизма соответствуют нижней трети нормального диапазона или ещё ниже, существенный лечебный эффект маловероятен.
Биохимические маркёры используются для решения вопроса о необходимости лекарственной терапии у женщин после менопаузы: чем выше значения костного метаболизма и чем ниже величина костной плотности по сравнению с нормальными значениями, тем больше необходимость назначения лекарственной терапии. Определение активности костного метаболизма, возможно, позволит врачу корректировать назначаемую терапию, до подтверждения диагноза денситометрическими методами.
Результаты многих клинических испытаний, позволяют считать, что маркёры костного метаболизма могут использоваться для прогнозирования действия антирезорбционной терапии на массу костной ткани. Расчёты, основывающиеся, с одной стороны на точности измерения массы костной ткани путём двухэнергетической рентгеновской абсорциометрии поясничного отдела позвоночника, с другой, на ожидаемых изменениях этого показателя под влиянием лечения, показывают, что для эффективности терапии у отдельно взятого пациента может потребоваться наблюдение в течении до 2-х лет. Повторное определение уровня костных маркёров позволяет сократить этот срок до 3-х месяцев.
Определение уровня биохимических маркёров резорбции и ремоделирования кости позволяет:

при профилактическом обследовании выявить пациентов с метаболическими нарушениями процессов ремоделирования и резорбции костной ткани;

оценить и прогнозировать уровень потери костной массы;

дать оценку эффективности назначенной терапии уже через 2 — 3 месяца;

выбрать наиболее эффективный препарат и определить оптимальный уровень его дозировки индивидуально для каждого пациента;

быстро оценить эффективность проводимой терапии и существенно сократить материальные и временные затраты пациента на лечение.

ВАЖНО!

Информация проверена экспертом

Лишова Екатерина Александровна

Высшее медицинское образование, опыт работы — 19 лет

Поделитесь этой статьей сейчас

Диагностика

Клиника КДЦ24 предлагает широкий спектр медицинских услуг, направленных на лечение, диагностику и профилактику заболеваний. Европейские стандарты качества, внимание и чуткость к каждому пациенту и современный подход к лечению — все это клиника КДЦ24!

Наши врачи – команда опытных специалистов, владеющих всеми необходимыми знаниями и навыками. Прежде чем приступить к работе, каждый врач проходит профессиональный отбор, подтверждающий его квалификацию и мастерство. Весь медицинский персонал, в особенности доктора нашей клиники, постоянно повышают свою квалификацию и участвуют в отечественных и зарубежных конференциях.

Качество предоставляемых медицинских услуг. Работа наших врачей нацелена на результат и выздоровление наших пациентов. Администрация нашей клиники постоянно контролирует качество оказываемых нашим пациентам медицинских услуг.

Техническая оснащенность. КДЦ24 оснащен самым современным диагностическим оборудованием, необходимым для точной постановки диагноза и назначения правильной программы лечения.

Индивидуальный подход. Наша клиника придерживается принципов персонализированной медицины, индивидуального подхода к каждому пациенту, что позволяет добиться максимальных положительных результатов лечебного и диагностического процесса. Доброжелательность, соучастие в проблемах наших пациентов, помощь в любой ситуации – это принцип работы нашего персонала.

Приемлемые цены на услуги диагностики. Мы разработали уникальные программы скидок, которые помогут вам сэкономить.

Мы проведем качественную диагностику заболеваний органов и систем, тем самым установим точные причины ваших проблем со здоровьем.

Записаться на консультацию и узнать подробнее Вы можете у администратора по телефону +7 (495) 356-30-03.

охтзывы, врачи, цены, запись на прием – Meds.ru

Отзыв о враче: Гиряева Наталья Петровна (Функциональный диагност)

Доктор с добрым сердцем

–

https://m.facebмаook.com/reg/?cid=103&next=%2Flevchiknat&refsrc=https%3A%2F%2Fm.facebook.com%2Flanguage.php&soft=hjk

, 01 August 2020 г.

Отзыв о враче: Котенко Роман Михайлович (Акушер-гинеколог, Репродуктолог, УЗИ-диагност)

У меня всегда были очень болезненные менструации, а в последнее время начало очень болеть внизу живота и периодически случались кровотечения. Потому я решилась прийти на прием к Роману Михайловичу. Он сразу же отправил меня на процедуру ультразвуковой диагностики. На основе полученных данных, доктор начал лечить меня он эндометриоза. Я очень переживала, что из-за этой болезни, я не смогу стать мамой. Но мне повезло, доктор меня вылечил, а потом мы бросили все силы на подготовку к беременности. Он замечательный, рекомендую.

–

Соня

, 14 January 2020 г.

Отзыв о враче: Марчук Александр Валерьевич (Массажист)

Подробно расспросил о диагнозе. Явно учёл эту информацию в процессе.

–

Артём

, 05 April 2019 г.

Отзыв о враче: Постников Юрий Иванович (Функциональный диагност, УЗИ-диагност)

Хорошо провел исследования, все что необходимо врач увидел, быстро и грамотно

–

Наталья

, 26 March 2019 г.

Отзыв о враче: Заворзаева Алла Викторовна (Акушер-гинеколог)

Наблюдаюсь у Аллы Викторовны уже 4-й год, очень довольна ее профессионализмом, грамотным подходом. Всегда даст опытный совет, прекрасный доктор. Рекомендую!

–

Наталья

, 26 March 2019 г.

Отзыв о враче: Островская Ольга Васильевна (Акушер-гинеколог)

Дорогая Ольга Васильевна!Очень вас не хватает в Омске.После родов,приехала к вам на прием.и узнала,что вы теперь в Моске!Рада за вас))Вы чудо-доктор.Очень вам благодарна.Доченьке моей уже почти 3 года!С одним яичником все получилось у нас))Благодаря граммотному лечению!Крепко вас обнимаю.Здоровья вам и благодарных пациентов. Настя «цветочек» Омск.

–

Анастасия

, 08 March 2018 г.

Отзыв о враче: Воронкова Наталья Васильевна (Гастроэнтеролог, Гепатолог)

Гастрит — вот, что я заработал не правильно питаясь на протяжении многих лет. Когда уже припекло обратился к Наталье Васильевне. Она провела обследование, просмотрела результаты анализов и назначила лечение. Не знаю, чтобы я делал если бы не Наталья Васильевна. Огромная благодарность.

–

Дима

, 04 February 2017 г.

Отзыв о враче: Майчак Алексей Андреевич (Стоматолог-терапевт)

Обращалась к Алексею Андреевичу за удалением зубного камня. Кроме этого сделала профессиональную чистку. Теперь мои зубы выглядят здоровыми и белоснежными. Горжусь, что у меня такой классный стоматолог!

–

Яна

, 18 January 2017 г.

Отзыв о враче: Топоров Валерий Николаевич (Офтальмолог)

Для подтверждения диагноза катаракты у отца обратились к лучшему специалисту офтальмологу. Валерий Николаевич предложил провести операцию по заменен хрусталика. Операция не дешевая, но здоровье близкого человека дороже. Благодаря профессиональному опыту врача все обошлось хорошо. Зрение у отца восстановилось.

–

Игорь

, 08 January 2017 г.

Общий прайс/цены/стоимость медицинских услуг в клинике «Аллегро» в Ижевске

Консультации врача стоматолога-терапевта
Стоматолог-терапевт первичный прием	500
Стоматолог-терапевт повторный прием	400
Стоматолог-терапевт профилактический прием	400
Диагностические исследования
Дентальный радиовизиографический снимок	300
Манипуляции врача стоматолога-терапевта
Аппликационная анестезия	150
Восстановление стенки зуба (Фуджи)	700
Временное пломбирование каналов (метапаста, метапекс)	550
Диатермокоагуляция десневого сосочка одного корневого канала	150
Закрытие одной фиссуры герметиком	700
Закрытие перфорации, витальное покрытие пульпы	600
Извлечение фиксированного инородного тела из корневого канала	550
Инстилляция. Лечение пародонтального кармана	250
Коррекция пломбы	600
Лечение гиперестезии эмали (десенситайзер)	250
Лечение одного корневого канала (противовоспалительные и кальцийсодержащие пасты)	500
Лечение пульпита и периодонтита двух каналов	1700
Лечение пульпита и периодонтита одного канала	1400
Лечение пульпита и периодонтита трёх каналов	1900
Лечение пульпита и периодонтита четырёх каналов	2200
Лечение слизистой полости рта с использованием плазмы	1950
Наложение лечебной прокладки	400
Нанесение пародонтальной повязки на один сегмент	300
Оказание неотложной помощи при острой боли (при пульпите, периодонтите)	700
Пломба одного зуба в трёх плоскостях. Фотокомпозит (III кл.)	2000
Пломба одного зуба в четырёх плоскостях. Фотокомпозит (IV кл.)	2200
Пломбирование одного зуба (стеклоиномерный цемент)	1450
Пломбирование одного зуба в двух плоскостях. Фотокомпозит (II кл.)	1900
Пломбирование одного зуба в одной плоскости. Фотокомпозит (I,V кл.)	1800
Пломбирование одного корневого канала (гуттаперча+силлер)	400
Полное восстановление коронки зуба	2700
Постановка временной пломбы	500
Проведение карпульной анестезии (ультракаин, артикаин)	300
Распломбировка одного корневого канала (паста, гуттаперча)	500
Распломбировка одного корневого канала (резорцин-формалин, цемент)	700
Снятие зубных отложений с помощью ультразвука с одного зуба	300
Снятие пластмассовой, цельнолитной, штампованной искусственной коронки	500
Снятие пломбы, трепанация зуба	600
Ультразвуковая обработка корневого канала	200
Фторирование одного зуба	200
Шинирование одного зуба	1000
Шлифовка, полировка реставрации	250
Эндоотбеливание коронки одного зуба	700

Структурная основа для PRC2-декодирования меток активного метилирования гистонов h4K36me2 / 3

Существенные изменения:
1) Один из основных выводов, к которым пришли авторы, заключается в том, что щель, с которой h4K36 связывается на границе раздела EZh3-нуклеосомной ДНК, не соответствует мутациям h4K36A и h4K36R или метилированным формам h4K36 (т.е. h4K36me2 и h4K36me3), что приводит к аллостерическому ингибированию. PRC2. Структура комплекса нуклеосома-PRC2 (рисунок 1 — рисунок в приложении 4E) показывает, что боковая цепь K36 участвует в нескольких взаимодействиях в этой щели и не контактирует с нуклеосомной ДНК.Кроме того, существует относительно большое незанятое пространство в щели между боковой цепью K36 и ДНК, что позволяет предположить, что в нее могут поместиться аминокислоты, размер которых превышает размер лизина. Моделирование мутации K36R показывает, что боковая цепь аргинина может быть размещена в щели связывания K36 без конфликтов. Учитывая их аналогичный размер, метилированные формы K36 также могут уместиться в щели связывания h4K36. Утверждение о том, что щель на границе раздела EZh3-ДНК подходит для лизина (K36), но не может вместить более крупные аминокислоты, неубедительно в отсутствие дополнительных данных.
2) Механизм, с помощью которого связывание h4K36 на границе раздела EZh3-нуклеосомная ДНК аллостерически регулирует ферментативную активность PRC2, четко не установлен. Структура нуклеосома-PRC2 обнаруживает одно потенциальное полярное взаимодействие между боковой цепью K36 и остовом Gln570 в EZh3, что указывает на отсутствие специфичности в распознавании K36. Напротив, было показано, что другие белки, которые специфически распознают немодифицированные лизины в N-конце гистона h4, делают это через сеть водородных связей и / или взаимодействий солевого мостика (например,g., узнавание h4K4 доменом PHD BHC80; Lan et al. (2007) Nature 448, 718-22). Маловероятно, что одиночное (потенциальное) полярное взаимодействие аллостерически регулирует активность метилтрансферазы PRC2.

Мы согласны с комментарием о том, что боковая цепь аргинина, триметилированного лизина или аланина теоретически может быть размещена в щели между доменом EZh3 ^CXC и ДНК. Наши формулировки в частях текста, которые мы использовали в оригинальной рукописи (т.е. значение того, что более объемные боковые цепи ингибируют) было выбрано неудачно, и мы заменили первое предложение в разделе «Немодифицированный h4K36 в интерфейсе взаимодействия EZh3 _CXC -ДНК имеет решающее значение для метилирования h4K27 в нуклеосомах», написав «Размещение h4K36 в нуклеосомах». Интерфейс EZh3 _CXC -DNA (Figure 1F) предполагает, что даже если три- или диметилированная боковая цепь K36 теоретически может быть размещена в этом интерфейсе, эти модифицированные боковые цепи могут обеспечивать менее оптимальную подгонку и тем самым ингибировать метилирование h4K27.”

Рецензент написал: «K36 участвует в нескольких взаимодействиях в этой щели и не контактирует с нуклеосомной ДНК». Мы, конечно, знаем, что для электростатических взаимодействий между аминокислотами в белках обычно требуются расстояния менее 4 Å. Однако мы хотели бы быть осторожными и не исключать возможные (дальнодействующие) электростатические взаимодействия боковой цепи K36 с фосфатным остовом нуклеосомной ДНК. Во-первых, следует иметь в виду, что глобальное разрешение нашей структуры находится в диапазоне 4.4 Å. Во-вторых, то, что может выглядеть как «статическая геометрия» в структуре, определенно не статично в растворе, и геометрия связывания может слегка изменять угол взаимодействия ДНК EZh3, в зависимости от длины нуклеосомной линкерной ДНК, последовательности ДНК вокруг октамера гистонов и т. Д. Мы изменили предложение в разделе, где мы описываем структуру, чтобы включить слово «возможно», то есть теперь оно гласит: «Плотность боковой цепи h4K36 предполагает, что эпсилон-аминогруппа h4K36 участвует в полярное взаимодействие с карбонильной группой Q570 и, возможно, в электростатических взаимодействиях дальнего действия с фосфатным остовом нуклеосомной ДНК (Рисунок 1F, Рисунок 1 — рисунок в приложении 4 CE).”

Следует подчеркнуть, что именно связывание ДНК является движущей силой взаимодействия PRC2 с нуклеосомами (Choi et al., 2017; Wang et al., 2017). Вклад взаимодействий гистонового хвоста в связывание нуклеосом на самом деле не поддается измерению, потому что он находится в совершенно другом диапазоне сродства связывания. Kd PRC2 для связывания с нуклеосомами составляет около 60 нМ. Kd PRC2 для связывания с немодифицированным хвостовым пептидом h4 [21-41] на 3 порядка выше (29 мкМ), а для связывания с подходящим пептидом h4K36me3 — 18 мкМ (Jani et al., 2019).

Мы обнаружили, что PRC2 связывает немодифицированные и модифицированные h4K36me3 нуклеосомы со сравнимой аффинностью (рис. 3), но что метилирование h4K27 на нуклеосомах h4Kc36me3 примерно в 10-20 раз менее эффективно, чем на немодифицированных нуклеосомах. Другими словами, K27 на K36me3-модифицированном h4 все еще должен быть способен продуктивно взаимодействовать с каталитическим центром, но, возможно, частота продуктивных взаимодействий в 10-20 раз ниже. То же самое, конечно, верно для h4K36R или h4K36A, где ингибирование образования h4K27me3 примерно в 5 раз (т.е.е. как показано на рисунке 3). Итак, хотя мы согласны с тем, что h4K36me3, h4K36R или h4K36A, вероятно, могут быть размещены в той же щели, что и h4K36, мы, однако, предполагаем, что время пребывания этого взаимодействия уменьшается и, следовательно, h4K27 взаимодействует с активным сайтом с более низкой частотой.

Таким образом, мы думаем, что возможный сценарий мог бы заключаться в том, что присутствие немодифицированной боковой цепи нативного лизина в положении 36 гистона h4 важно в динамике реакционного цикла, который включает (i) стыковку комплекса с нуклеосомой через EZh3 ^CXC -ДНК контакты, (ii) выравнивание N-конца h4 на поверхности EZh3 (iii) стыковка стороны h4K27 с каталитическим центром для метилирования его боковой цепи.Это то, что мы предложили в разделе «Обсуждение»: «Взятые вместе, возможный сценарий, следовательно, будет заключаться в том, что в пределах временных рамок связывания PRC2-нуклеосомы и цикла реакции стыковка боковой цепи h4K36 в интерфейсе EZh3 _CXC-ДНК. критически важен для быстрого выравнивания N-конца h4 на поверхности EZh3 в каталитически компетентное состояние ».

3) Авторы объясняют потерю h4K27me3 у мутантов h4K36A и h4K36R Drosophila с аллостерическим ингибированием PRC2.Однако эти мутации также уменьшают h4K36me3 в развивающихся эмбрионах и личинках Drosophila . Drosophila PRC2 вспомогательная субъединица Pcl, как было показано, связывает h4K36me3, аналогично ее гомологу PHF1 млекопитающих (Ballare et al., 2012; Musselman et al., 2012). Т.о., глобальная потеря h4K36me3 может приводить либо к снижению рекрутирования, либо к неправильной локализации PRC2 в хроматине. Авт. Должны исследовать, влияют ли мутации h4K36A и h4K36R на локализацию PRC2 в хроматине относительно Drosophila дикого типа.

Утверждение: «Было показано, что вспомогательная субъединица Pcl Drosophila PRC2 связывает h4K36me3, аналогично ее гомологу PHF1 у млекопитающих (Ballare et al., 2012; Musselman et al., 2012)». это неверно. Структура tudor домена Drosophila Pcl была определена в 2010 и обнаружила, что Pcl tudor лишен ароматической клетки и не связывается с метилированными лизинами или аргининами (Friberg et al., 2010). Musselman et al. и Ballare et al. исследования 2012 года показали, что хотя tudor-домен PHF1 действительно связывается с пептидами h4K36me3, tudor-домен Drosophila Pcl не связывает h4K36me3 (Ballare et al., 2012, Figure 2B) и та мутация двух ароматических остатков в tudor домене PHF1, которые отсутствуют в tudor домене Pcl, отменяет связывание h4K36me3 с помощью tudor домена PHF1 (Musselman et al., 2012).

Чтобы напомнить читателю об этой разнице, мы добавили предложение в конце абзаца, в котором описываются результаты анализов HMTase с PHF1-PRC2 на нуклеосомах h4Kc36me3:

«В этом контексте следует также отметить, что у Polycomblike, ортолога PHF1 Drosophila tudor домен содержит неполный ароматический каркас и не может связывать метилированные лизины (Friberg et al., 2010; Musselman et al., 2012; Ballare et al., 2012) ».

Следует также иметь в виду, что в Drosophila PRC2 задействован в элементах ответа Polycomb (PRE). Нацеливание PRC2 на PREs требует Pho (Wang et al., Mol Cell 2004; Frey et al., G&D 2006) и Pcl (Nekrasov et al., 2007; Savla et al., Development 2008). Более того, PRE обеднены нуклеосомами (Papp and Müller, G&D 2006; Schwartz et al. JBC 2006 и многие другие исследования с тех пор). Таким образом, нет оснований для сценария, в котором h4K36me2 / 3 будет задействован в нацеливании на PCl ^— PRC2.

Автор обзора попросил создать профили связывания PRC2 в Drosophila с хроматином h4K36R или h4K36A. В связи с недавним ухудшением ситуации с пандемией в Германии мы не смогли собрать большое количество материала имагинального диска, который потребовался бы для выполнения анализа ChIP-seq для сравнения полногеномных профилей связывания субъединицы PRC2 у дикого типа и мутантные личинки h4K36R. Маловероятно, что мы сможем провести этот эксперимент в ближайшее время. Учитывая это и учитывая, что мы находимся в конкурентной ситуации с рукописью из лаборатории Евы Ногалес, в которой также сообщается о режиме связывания h4 и роли h4K36, мы просим рецензентов не настаивать на включении этого эксперимента.

4) Авторы используют человеческий PRC2 полной длины в комплексе с PHF1 для исследований Cryo-EM и в экспериментах по связыванию нуклеосом. В исследованиях Cryo-EM они не могут определить плотность для N-концевой части SUZ12, RBBP4 и N-концевой части PHF1. В нескольких публикациях было показано, что эти части комплекса PRC2 важны для локализации PRC2 в специфических сайтах генома. Хотя авт. Не проверяют это напрямую, N-терминальная часть SUZ12 и RBBP4, скорее всего, важна для связывания (аффинности), которое авторы измеряют в EMSA.Если это действительно верно, авт. Должны принять это во внимание при обсуждении относительного вклада различных частей PRC2 в сродство связывания ДНК и нуклеосом.

Это полезный комментарий. Мы расширили обсуждение этого вопроса. Теперь текст гласит:

«Связывание нуклеосом с помощью комплекса PRC2 ^{CXC> A / EED> A} может частично быть связано с неполным нарушением мутированных интерфейсов, но, вероятно, также представляет собой связывание нуклеосом, вносимое нижней долей PRC2, содержащей N-член SUZ12. и RBBP4 (Chen et al., 2018; Некрасов и др., 2005). […] В заключение, структурные данные (рис. 1C, D и Poepsel et al., 2018) предполагают, что ключевое взаимодействие PRC2 с нуклеосомами субстрата происходит через контакты домена EZh3 _CXC с круговоротами ДНК, тогда как биохимические анализы утверждают, что это взаимодействие лишь незначительно влияет на общую аффинность связывания хроматина комплекса ».

5) В описании в тексте указано, что PRC2 ^{CXC> A} и PRC2 ^{EED> A} имеют аналогичный дефицит силы связывания в анализах EMSA, что также показано в количественной оценке (Рисунок 2B), однако на основании гели (рис. S5A), мутант EED, по-видимому, действует аналогично PRC2 WT? Либо это плохо выбранный пример (из трех повторностей, используемых для количественной оценки), либо мы сомневаемся, достаточно ли качество изображения геля для этого количественного определения.

Мы согласны с тем, что гель на рисунке S5A, сравнивающий связывание нуклеосом PRC2 ^{EED> A} и контроль PRC2 дикого типа рядом с ним, не был самым хорошим гелем, но это был единственный гель, в котором мы использовали контроль дикого типа напрямую. рядом с мутантом.

Мы удалили рисунок S5A и теперь показываем EMSA с PRC2 ^{EED> A} на рисунке 2A. Изображение геля PRC2 ^{EED> A} EMSA (дорожки 31-40) имеет ту же экспериментальную установку, что и на левой панели (дорожки 1-30), но выполнено на отдельном геле.

6) Эксперименты EMSA (рис. 2A и S5A) выполняются исключительно на мононуклеосомах, что, по-видимому, означает, что только одна из изученных поверхностей связывания PRC2 (CXC против EED) может быть задействована одновременно. В этом сценарии мутация одной связывающей поверхности предположительно позволит другой поверхности «захватить власть». Учитывая различную ферментативную активность, наблюдаемую для PRC2 ^{CXC> A} на моно- и динуклеосомах, было бы важно знать, насколько хорошо этот мутант связывает динуклеосомы.Как вариант, авторы обсуждают этот аспект в рукописи.

Мы выполнили EMSA с целью анализа связывания PRC2 с динуклеосомами. Однако мы наблюдали сложную смесь медленно мигрирующих видов, и это помешало дальнейшим экспериментам, направленным на различение событий связывания с участием специфических поверхностей PRC2 с использованием динуклеосом в качестве связывающих субстратов.

Мы обсуждаем этот аспект более подробно в новой редакции рукописи:

Связывание нуклеосом

комплексом PRC2 ^{CXC> A / EED> A} может частично быть связано с неполным нарушением мутированных интерфейсов, но, вероятно, также представляет собой связывание нуклеосом, вносимое нижней долей PRC2, содержащей N-член SUZ12 и RBBP4 (Chen et al., 2018; Некрасов и др., 2005). В частности, биохимические исследования на Drosophila PRC2 первоначально обнаружили, что минимальный комплекс, образованный между Su (z) 12 и ортологом RBBP4 Caf1-55, связывается с нуклеосомами (Nekrasov et al., 2005). Более того, EM-анализ негативного окрашивания PRC2 человека, связанного с динуклеосомой, выявил несколько 2D классов, нижняя доля которых контактирует с одной или двумя нуклеосомами динуклеосомы (Poepsel et al., 2018). Таким образом, аффинность связывания корового комплекса PRC2 с хроматином, по-видимому, является результатом взаимодействий по крайней мере трех различных сложных поверхностей с нуклеосомами, доменом EZh3 _{, CXC}, интерфейсом связывания нуклеосомы EED и долей SUZ12 _N: RBBP4.Учитывая архитектуру каталитической доли (рис. 1C) и изолированного полного комплекса ядра PRC2 (Kasinath et al., 2018), очень маловероятно, что домен EZh3 _CXC и интерфейс связывания нуклеосомы EED могут одновременно взаимодействовать с одна и та же нуклеосома за раз. Наконец, мы отмечаем, что в EMSA, контролирующих связывание PRC2 с динуклеосомами, мы наблюдали сложную смесь медленно мигрирующих видов, и это препятствовало экспериментам, направленным на различение событий связывания с участием специфических поверхностей PRC2 с динуклеосомами.В заключение, структурные данные (рис. 1C, D и Poepsel et al., 2018) предполагают, что ключевое взаимодействие PRC2 с нуклеосомами субстрата происходит через контакты домена EZh3 _CXC с круговоротами ДНК, тогда как биохимический анализ утверждает, что это взаимодействие вносит лишь незначительный вклад в общую аффинность связывания хроматина комплекса.

7) В целом, одно ограничение в этом экспериментальном подходе состоит в том, что мы не можем адекватно различить эффект мутации конкретных сайтов икак мутации могут вызывать общие конформационные изменения в PRC2, вносящие вклад в измененную силу связывания. Кроме того, в заключительном заявлении не принимается во внимание, что введение мутаций в домен CXC может изменить конформацию EZh3 (или ядра PRC2) таким образом, что напрямую влияет на каталитическую активность, поэтому потеря h4K27me3 на рисунке 2C также может происходят из общего снижения ферментативной активности, а не (только) из-за уменьшения связывания нуклеосом через эту специфическую поверхность, особенно с учетом довольно скромного влияния на силу связывания, показанного на рисунке 2A.Чтобы различать эффекты на общую каталитическую активность и снижение связывания, авторы могли выполнить анализы метилтрансферазы in vitro на пептидных субстратах (как на рисунке 3D), используя мутант домена CXC.

Это хороший контроль, и теперь мы добавили этот эксперимент в исправленную версию. PRC2 ^{CXC> A} не проявлял пониженной активности метилирования K27 по сравнению с PRC2 дикого типа на пептидном субстрате h4. Новые данные показаны на рисунке 2 — приложение к рисунку 1B, а результаты обсуждаются в тексте:

«В дополнение к этим экспериментам мы также сравнили HMTase активность комплекса PRC2 и PRC2 ^{CXC> A} дикого типа на пептидах свободного гистона h4 _18-42, используя масс-спектрометрический анализ для обнаружения метилирования h4K27.Хорошо известно, что PRC2 дикого типа метилирует K27 на свободном гистоне h4 с гораздо меньшей эффективностью, чем на h4 в нуклеосомах (Cao et al., 2002; Czermin et al., 2002; Kuzmichev et al., 2002; Muller et al. , 2002), и это также резюмируется в наших анализах пептидов h4 _18-42, где мы в первую очередь обнаруживаем h4K27me1, но не формируем h4K27me3, даже после продолжительной инкубации реакции (см. Рисунок 2 — рисунок в приложении 1B и сравните с рисунком 2C. ). Однако важно отметить, что PRC2 ^{CXC> A} не проявляет сниженной активности метилирования K27 по сравнению с PRC2 дикого типа на этом пептидном субстрате h4 (фигура 2 — приложение к рисунку 1B).Таким образом, мутации в домене EZh3 ^CXC, по-видимому, не изменяют конформацию EZh3 таким образом, чтобы напрямую мешать катализу ».

8) Интерпретации рисунков 4A и 4B трудно следовать из представленных данных: Вестерн-блот, представленный на рисунке 4B, не сильно подтверждает вывод о 3-4-кратном глобальном снижении h4K36me2 / me3 (полосы довольно «Размыты» на дорожках 5-8). Авторы далее заявляют, что снижение h4K36me2 / me3 менее выражено у эмбрионов h4K36A по сравнению с эмбрионами.h4K36R личинки — и что это может представлять собой метилированный h4.3 (который предположительно также может иметь место для h4K36R), но также депонированный от матери канонический h4 дикого типа. Чтобы подтвердить это предположение, авторы должны сравнить разные генотипы на одних и тех же стадиях развития — таким образом, значимое сравнение должно включать мутантные эмбрионы h4K36R (поскольку мутанты h4K36A умирают до личиночной стадии).
9) Точно так же было бы интересно увидеть данные ChIP, полученные на эмбрионах h4K36R, чтобы лучше оценить, является ли очевидное отсутствие (по WB, рис. 4B) или очень скромное (по ChIP, рис. 4D) снижение h4K27me3 в мутантных эмбрионах h4K36A. механистическая разница между h4K36A vs.h4K36R или просто разница в стадиях развития.

Первоначально мы фактически проанализировали объемные уровни h4K36me2 / me3 и h4K27me3 в мутантных эмбрионах h4K36R параллельно с анализом на мутантных эмбрионах h4K36A (прогоняли тот же гель), и мы также выполнили анализы h4K36me2 и h4K27me3ChIP-seq в мутантных эмбрионах h4K36R. См. Https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.22.054684v1.full.pdf). Затем мы выполнили анализ мутантных личинок h4K36R, где замена wt h4 на h4K36R является более полной, и — для простоты, но, возможно, неразумно — удалили данные о мутантных эмбрионах h4K36R из представления eLife .Теперь мы добавили вестерн-блоттинг и анализ ChIP-seq в мутантных эмбрионах h4K36R на рис. 5B, D и F.

Относительно комментария о том, что « Вестерн-блоттинг», представленный на рисунке 4B, не сильно подтверждает вывод о 3-4-кратном глобальном снижении h4K36me2 / me3 (полосы довольно «размыты» на дорожках 5-8). ”, Мы добавили изображение ответа автора 1 с переэкспонированными необрезанными изображениями этого вестерна. Как проиллюстрировано на этом рисунке, действительно наблюдается явное снижение h4K36me2 и -me3 в экстрактах из мутантных эмбрионов h4K36A, вестерн против h3B той же мембраны, показанный на изображении ответа автора 1, служит контролем.Мы оцениваем снижение уровней h4K36me2 и -me3 в мутантных эмбрионах h4K36A (рис. 4B, дорожки 5-8) по сравнению с эмбрионами дикого типа (рис. 4B, дорожки 1-4) примерно в 3-4 раза.

Неожиданно мы обнаружили, что у мутантных эмбрионов h4K36R снижение h4K36me3 менее серьезное, а в случае h4K36me2 мы не смогли обнаружить четкого сокращения (рис. 5B, дорожки 9-12).Мы использовали штамм h4K36R, который мы создали в этом исследовании (4 копии мини-массива 3xHisGU ^h4K36R ), и поэтому эффекты напрямую сопоставимы с эффектами, наблюдаемыми у мутантных эмбрионов h4K36A, несущих 4 копии 3xHisGU ^h4K36A. мини-массив. Менее серьезное снижение количества мутантных эмбрионов h4K36R по сравнению с мутантными эмбрионами h4K36A также подтверждается данными профилирования h4K36me2 по всему геному у этих эмбрионов (рис. 5D, графики слева).Простая техническая причина, такая как перекрестная реактивность антител h4K36me2 и h4K36me3, специфически с h4K36R, кажется маловероятной, учитывая сильное снижение сигналов h4K36me2 и h4K36me3 в экстрактах от мутантных личинок h4K36R (показано на рисунке 4A). В настоящее время у нас нет объяснения, почему уровни h4K36me2 и h4K36me3, по-видимому, лишь очень незначительно снижены у мутантных эмбрионов h4K36R, и мы указываем это в тексте. Однако в анализах ChIP-seq мы, тем не менее, наблюдаем, что уровни h4K27me3 на HOX снижены у мутантных эмбрионов h4K36R (Рисунок 4F).Следовательно, в генах HOX отложение h4K27me3, по-видимому, одинаково нарушено у мутантных эмбрионов h4K36A и h4K36R. Эти результаты описаны и обсуждаются:

«У мутантов h4 ^K36A объемные уровни h4K36me2 и h4K36me3 были явно снижены по сравнению с дикого типа (Рисунок 5B, сравните дорожки 5-8 с 1-4). У мутантов h4 ^K36R объемные уровни h4K36me2 и h4K36me3 неожиданно оказались гораздо менее сильно сниженными (Рисунок 5B, сравните дорожки 9-12 с 1-4 и 5-8).Как обсуждалось выше, остаточный сигнал h4K36me2 и h4K36me3 в мутантных эмбрионах h4, ^K36A и h4 ^K36R может частично представлять модифицированные депонированные от матери канонические h4 дикого типа и частично модифицированные варианты h4.3. Однако причина дифференциального снижения уровней h4K36me2 и -me3 у мутантных эмбрионов h4 ^K36A и h4 ^K36R остается неясной. В обоих генотипах объемные уровни h4K27me3 оказались в значительной степени неизменными по сравнению с дикого типа (фиг. 5B, сравните дорожки 5-8 и 9-12 с 1-4).”

«Как и ожидалось на основании анализа вестерн-блоттинга (рис. 5В), h4 ^K36A или h4 ^K36R мутантные эмбрионы не показали общего снижения их полногеномных профилей h4K27me3 (рис. 5D). Однако у обоих мутантов уровни h4K27me3 были примерно в 1,5 раза снижены по локусам гена HOX (рис. 5D, F) ».

10) Как авторы объясняют / размышляют об отсутствии / умеренном влиянии на h4K27me3 у мутантных эмбрионов h4K36A, несмотря на тяжесть фенотипа этих мутантов? Здесь, опять же, уместным будет параллельное сравнение уровней h4K27me3 в h4K36R и h4K36A мутантных эмбрионах.Также важно учитывать знания о количестве клеточных делений и нагрузке материнскими гистонами, чтобы оценить, влияет ли также h4K36A на метилирование h4K27 in vivo.

Как обсуждалось в нашем ответе на комментарии 8 и 9, для вестерн-блоттинга и ChIP-seq анализов у эмбрионов мы использовали штаммы h4K36A и h4K36R, которые мы создали в этом исследовании, то есть гомозигот Df HisC , спасенных 4 копиями 3xHisGU ^h4K36A miniarray и 4 копии 3xHisGU ^h4K36R miniarray соответственно.Таким образом, эффекты на h4K36me2 и -me3 напрямую сопоставимы.

Мы обсуждаем разницу в летальности различных мутантных штаммов в основном тексте:

«Мутантные животные h4 ^K36R из штамма, созданного в этом исследовании (т.е. содержащие 4 копии миниатюры 3xHisGU ^h4K36R ), также завершили эмбриогенез, и их морфология кутикулы также неотличима от дикого типа (рис. 4). Однако 98% особей остановили развитие уже в конце эмбриогенеза, а 2% мутантных животных, вылупившихся из яичной скорлупы, остановили развитие в качестве личинок первого возраста (рис. 4). h4 ^K36A мутанты, содержащие 4 копии миниатюры 3xHisGU ^h4K36A , также завершили эмбриогенез, и морфология их эмбриональной кутикулы также оказалась неотличимой от дикого типа (рис. 4). 96% этих мутантных животных h4 ^K36A остановили развитие до вылупления из яичной скорлупы, а 4% вылупившихся животных погибли в течение первого личиночного возраста (рис. 4). Как обсуждалось в разделе «Материалы и методы», разница в фазе летальности мутантов h4 ^K36R и h4 ^K36A , полученных в этом исследовании, по сравнению с мутантами h4 ^K36R в штамме от Matera и коллег, возможно, связан с используемой системой трансгена спасения гистонов.”

Раздел «Материалы и методы» содержит более подробное обсуждение этого вопроса:

«Сравнение летальности мутантов h4 ^K36R и h4 ^K36A : разница в фазе летальности мутантов h4 ^K36R , полученных в этом исследовании, по сравнению с мутантами h4 ^K36R . в штамме от Matera et al. было неожиданным, поскольку в обоих штаммах гомозиготы Df (2L) HisC несут 12 копий кассеты HisGU ^h4K36R (т.е.е. четыре 3x HisGU ^h4K36R мини-массивов в нашем штамме и один массив 12x HisGU ^h4K36R в штамме от Matera и его коллег). Возможное объяснение более низкой выживаемости мутантов h4 ^K36R в штамме, полученном здесь, может заключаться в том, что экспрессия гистонового трансгена из миниатюрных массивов 3xHisGU ^h4K36R по какой-то причине менее эффективна, чем в случае 12x HisGU. ^h4K36R массив.Мы также отмечаем, что недавнее исследование показало, что среди гомозигот Df (2L) HisC , несущих 20 HisGU ^h4K36A копий, около 50% мутантных животных развиваются до стадий куколки (Zhang et al., 2019) . Zhang et al. не анализировали свои мутанты h4 ^K36A дальше, но возможно, что более высокое число копий кассеты HisGU ^h4K36A объясняет лучшую выживаемость по сравнению со штаммом h4 ^K36A , полученным в этом исследовании. .Потребуются дальнейшие исследования, чтобы выяснить, проявляют ли мутанты h4 ^K36R и h4 ^K36A сопоставимые фенотипы у личинок ».

В основном тексте мы также расширили наше объяснение проблемы перманентности депонированного материнским организмом гистона h4 дикого типа в мутантах h4K36R и h4K36A. В соответствующем разделе теперь указано:

«Для интерпретации следующих экспериментов важно иметь в виду, что h4 ^K36R и h4 ^K36A зиготические мутантные животные изначально также содержат пул депонированных от матери канонических молекул h4 дикого типа, которые вместе с h4 ^K36R и h4 ^K36A, включаются в хроматин во время циклов пре-бластодермального расщепления, вплоть до S-фазы клеточного цикла 14.Только начиная с S-фазы клеточного цикла 15 и далее, только гистоны, кодируемые трансгенами, затем включаются в хроматин (Gunesdogan et al., 2010). Хотя молекулы h4 дикого типа в хроматине становятся разбавленными во время каждого клеточного цикла и в конечном итоге полностью заменяются мутантным h4, они, вероятно, все еще присутствуют в хроматине эмбрионов на поздних стадиях. Эффективная замена персистирующих молекул h4 дикого типа мутантом h4 сильно варьируется между эмбриональными тканями из-за разного числа клеточных делений, которые происходят в разных тканях до окончания эмбриогенеза.Напр., Тогда как эпидермальные клетки претерпевают еще только два деления после S-фазы 14, некоторые клетки в ЦНС претерпевают целых 12 делений (Bossing et al., 1996). В диплоидных тканях мутантных личинок h4 ^K36R замена h4 дикого типа на h4 ^K36R будет гораздо более полной из-за обширной пролиферации клеток, которая происходит в этих тканях, которая после метаморфоза приведет к структуры взрослого тела ».

11) Утверждение в легенде на Рисунке 4E о том, что «для каждого гена HOX существует значительно большая доля клеток, в которых ген декорирован h4K27me3 и репрессирован Polycomb», вероятно, неверно: хотя анализируемые ткани, безусловно, являются смешанными В популяции с небольшим количеством клеток, показывающих экспрессию тестируемых генов HOX (рисунок 5), маловероятно, что большая часть генов показывает нормальный h4K27me3 — если бы это было так, данные ChIP на рисунке 4 не показали бы большого снижения h4K27me3 при проверенные локусы.Таким образом, данные, вероятно, отражают то, что h4K27me3 снижается в большинстве типов клеток — но дерепрессия наблюдается только в нескольких клетках — чтобы показать это, иммуноокрашивание на h4K27me3 должно быть включено в рисунок 5 (обсуждается ниже).

Мы согласны и изменили текст, чтобы удалить любые упоминания о доле клеток, в которых гены HOX неактивны и активны. Текст теперь гласит: «Для каждого гена HOX анализируемые ткани (ЦНС, грудные имагинальные диски и диски глаз-антенны) представляют собой смешанную популяцию клеток с долей клеток, в которых ген неактивен, украшен h4K27me3 и репрессирован PcG и фракция клеток, в которых ген транскрипционно активен и несет модификацию h4K36me2.”

Мы добавили новый рисунок данных (рисунок 6 — рисунок в приложении 1), который документирует снижение сигнала иммунофлуоресценции h4K27me3 в имагинальных дисках крыльев от личинок дикого типа и мутантных личинок h4K36R. Как и ожидалось, у мутантных личинок h4K36R восстановление h4K27me3 довольно равномерно в разных клетках, которые формируют крыловой диск. В качестве контроля специфичности сигнала IF h4K27me3 мы также показываем изображение крылового диска с клонами мутантных клеток h4K27R.

12) Авторы заявляют, что «наиболее прямая интерпретация» наблюдаемой неправильной экспрессии генов-мишеней Polycomb в личинках h4K36R заключается в том, что она является результатом снижения h4K27me3 в этих локусах.Хотя это вполне может иметь место в данном исследовании, потеря h4K27me3 также может быть вторичной по отношению к активации гена — различие, которое упускается из виду во многих исследованиях. В этом случае вопрос заключается в том, является ли потеря h4K27me3 прямым эффектом замены h4K36 или вторичной по отношению к изменениям экспрессии генов или измененному / задержанному развитию. В этом контексте авторы могли бы более решительно опираться на предыдущее наблюдение (McKay et al., 2015; Meers et al., 2017) о том, что мутант h4K36R не демонстрирует значительного нарушения регуляции экспрессии генов (как упоминалось в Обсуждении), и , что наиболее важно, следует подчеркнуть их собственные наблюдения, что глобальный h4K27me3 снижен (Рисунок 4A), а h4K27me3 в генах-мишенях Polycomb сильно снижен (Рисунок 4C), несмотря на низкий процент проанализированных клеток, показывающих неправильную экспрессию этих конкретных генов (Рисунок 5B-D). .Наряду с данными in vitro, представленными на Рисунке 2, это дает более убедительные доказательства прямого действия «интактного» h4K36 на сохранение нормальной активности PRC2.

Это хороший момент, и мы изменили основной текст, чтобы обсудить результат исследования Meers et al., 2017: «эти анализы транскриптомов не выявили какого-либо серьезного нарушения регуляции генов HOX или PcG». Мы также отмечаем, что неправильная экспрессия гена HOX у мутантов h4 ^K36R или h4 ^K36A является стохастической и не такой распространенной, как у сильных мутантов PcG.В частности, мы объясняем, что стохастическая неправильная экспрессия Ubx в отдельных клетках зачатка крыльев лопасти происходит в «области этого диска, где Ubx наиболее легко подавляется, если функция PcG нарушена (Beuchle et al., 2001)». . Точно так же мы объясняем, что « Antp неправильно экспрессируется в зачатке антенны, области имагинальных дисков глаза-антенны, где Antp наиболее подвержен неправильной экспрессии при нарушении функции PcG».

13) В том же духе было бы интересно включить иммуноокрашивание на h4K27me3 на рисунках 5B-D, чтобы узнать, является ли потеря h4K27me3 более заметной в клетках, демонстрирующих неправильную экспрессию, и чтобы подтвердить данные из рисунка 4, показывающие глобальное снижение из h4K27me3.

Как упоминалось в нашем ответе на комментарий 11, мы добавили новый рисунок данных (рисунок 6 — рисунок в приложении 1), который документирует снижение сигнала иммунофлуоресценции h4K27me3 в имагинальных дисках крыльев от личинок дикого типа и мутантных личинок h4K36R. Как и ожидалось, у мутантных личинок h4K36R восстановление h4K27me3 довольно равномерно в разных клетках, которые формируют крыловой диск. В качестве контроля специфичности сигнала IF h4K27me3 мы также показываем изображение крылового диска с клонами мутантных клеток h4K27R.

Мы также объясняем в тексте, что стохастическая неправильная экспрессия Ubx в отдельных клетках зачатка лопасти крыла происходит в «области этого диска, где Ubx наиболее легко подавляется, если функция PcG нарушена (Beuchle et al., 2001) ». Точно так же мы объясняем, что « Antp неправильно экспрессируется в зачатке антенны, области имагинальных дисков глаза-антенны, где Antp наиболее подвержен неправильной экспрессии при нарушении функции PcG».

В заключение, неправильная экспрессия генов HOX не связана с особенно серьезным сокращением h4K27me3 в определенных наборах клеток или частей тканей, а просто происходит стохастическим образом и наиболее легко возникает в тех клетках и тканях, где гены HOX также впервые становятся подавляется при удалении функции Polycomb (т.е. как показано в Beuchle et al., 2001).

[Примечание редакции: до принятия были предложены дальнейшие исправления, как описано ниже.]

В исправлениях авторов учтено большинство комментариев к исходной рукописи, а дополнительное обсуждение прояснило их модель того, как взаимодействия h4K36 с PRC2 могут влиять на его активность. Однако есть еще один момент, на который следует обратить внимание:
Утверждение авторов о том, что Drosophila Pcl не связывает h4K36me2 или h4K36me3, не совсем верно.Хотя Tudor-домен Pcl не распознает h4K36me2 / 3, Ballare et al. продемонстрировали, что конструкция Pcl Tudor-PHD1 действительно связывается с h4K36me2 и h4K36me3 (Ballare et al., 2012). Это открытие также явно указано в их статье: «Тем не менее, используя конструкцию Pcl Tudor-PHD1, мы смогли спасти связывание с h4K36me2 и h4K36me3 (Рисунок 2B)». Кроме того, Musselman et al., 2012 исследовали взаимодействия между Tudor-доменом PHF1 человека и h4K36me3, но не тестировали связывание доменов Pcl Tudor-PHD1 Drosophila с h4K36me2 или h4K36me3 (Musselman et al., 2012). В общем, авторы должны внести поправки в свою рукопись, чтобы подтвердить, что домены Drosophila Pcl Tudor-PHD1, как было показано, связываются с h4K36me2 и h4K36me3.

Мы отредактировали текст, чтобы решить оставшийся вопрос, поднятый рецензентами в отношении пересмотренной версии.

В частности, мы выяснили, что известно о связывании Polycomblike и h4K36me2 / 3 в Drosophila . Теперь текст гласит:

«В Polycomblike, ортолог Drosophila PHF1, область, содержащая tudor-домен и прилегающий палец PHD, как сообщается, связывает h4K36me3, h4K4me3, h4K9me3 и, в меньшей степени, также h4K14me3 и h4K27me3 (Ballaré et al., 2012). Мы отмечаем, однако, что tudor домен Polycomblike содержит неполный ароматический каркас и сам по себе неспособен связывать метилированные лизины (Friberg et al., 2010). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить, может ли взаимодействие PHF1 или Polycomblike с h4K36me3 изменить метилирование h4K27 с помощью PRC2 на более сложных олигонуклеосомных субстратах, которые содержат как модифицированные, так и немодифицированные нуклеосомы h4K36me3 ».

https://doi.org/10.7554/eLife.61964.sa2

Отрицательная обратная связь управляет гонадотропным частотным декодированием частоты пульса гонадотропин-высвобождающего гормона

Рисунок 3

GnRH увеличивает экспрессию гена FSHβ за счет активации ERK5.

(A) Клетки LβT2 культивировали и подвергали действию GnRH в течение 0–2 часов перед лизисом и вестерн-анализом с использованием антисыворотки pERK5 (верхняя панель) или общего ERK5 (нижняя панель). (B) Конструкция мышиного FSHβ-luc (200 нг) и векторы экспрессии ERK5 или конститутивно-активные MEK5 (D) или оба (50 нг каждый) трансфицировали в клетки αT3-1 в 96-луночных планшетах. Уровни люциферазы были нормализованы к уровням Renilla, и результаты показывают кратность индукции по сравнению с необработанными клетками, трансфицированными контролем FSHβ-luc. Среднее ± SEM, n = 6.ANOVA с последующим t-критерием Бонферрони для сравнения средних; несущественно различающиеся (p> 0,05) обозначены одной и той же буквой. (C) Клетки культивировали в 6-луночных планшетах и трансфицировали 2 мкг экспрессионных векторов ERK5 или MEK5 (D) или обоими; через 48 ч РНК экстрагировали для ОТ-ПЦР. Праймеры амплифицировали 856 п.н. FSHβ, 200 п.н. GnRH-R или 200 п.н. кДНК β-актина в качестве контроля. Ампликоны обрабатывали на агарозном геле, количественно определяли денситометрическим анализом, значения нормализовали по отношению к значениям β-актина и наносили кратные различия по сравнению с контрольными клетками.Среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 3. Статистический анализ (как на рисунке 3B) проводили отдельно для FSHβ (верхний регистр) или GnRH-R (нижний регистр). (D) Клетки LβT2 в 60-миллиметровых планшетах трансфицировали 4 мкг доминантно-отрицательной конструкции MEK5 (A) за 24 часа до обработки GnRH в течение 8 часов. РНК экстрагировали для ОТ-ПЦР; праймеры амплифицировали первые 225 п.н. FSHβ или 230 п.н. кДНК GAPDH в качестве контроля. (E) Точно так же клетки трансфицировали конструкцией MEK5 (A) перед обработкой GnRH в течение 3 или 8 часов, после чего РНК экстрагировали, подвергали обратной транскрипции и праймеры амплифицировали фрагмент кДНК GnRH-R или GAPDH, как контроль.Отмечено соотношение ампликона GnRH-R после нормализации с помощью GAPDH относительно уровней в необработанных образцах (с или без MEK5 (A).

doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.g003

Отрицательная обратная связь управляет гонадотропным частотным декодированием частоты пульса гонадотропин-высвобождающего гормона

Abstract

Синтез субъединиц гонадотропина направляется пульсирующим гонадотропин-рилизинг-гормоном (GnRH) из гипоталамуса, при этом частота импульсов GnRH регулирует дифференциальную экспрессию общей α-субъединицы, β-субъединицы лютеинизирующего гормона (LHβ). и β-субъединица фолликулостимулирующего гормона (FSHβ).Три митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK), ERK1 / 2, JNK и p38 вносят уникальный и комбинаторный вклад в экспрессию каждой из этих субъединичных генов. В этом исследовании, используя как экспериментальные, так и вычислительные методы, мы обнаружили, что необходима фосфатазная регуляция активности трех MAPK посредством отрицательной обратной связи с двойной специфичностью, и это является основой для декодирования частоты пульсирующего GnRH. Было показано, что четвертый MAPK, ERK5, также активируется GnRH. Было обнаружено, что ERK5 стимулирует активность промотора FSHβ и увеличивает уровни мРНК FSHβ, а также усиливает его предпочтение низким частотам импульсов GnRH.Последнее достигается за счет усиления сверхчувствительного поведения экспрессии гена FSHβ за счет увеличения числа MAPK-зависимостей и посредством модуляции прямых эффектов активации JNK на рецептор GnRH (GnRH-R). Наши результаты способствуют пониманию роли изменения частоты пульса GnRH в контроле транскрипции гонадотропинов гипофиза, что является важным аспектом в регулировании репродукции. Пульсирующие стимулы и осциллирующие сигналы являются неотъемлемой частью многих биологических процессов, и выяснение механизмов, с помощью которых декодируется пульсация, объясняет, как один и тот же стимулятор может приводить к различным результатам в одной клетке.

Образец цитирования: Lim S, Pnueli L, Tan JH, Naor Z, Rajagopal G, Melamed P (2009) Отрицательная обратная связь управляет частотой гонадотропного декодирования частоты импульсов гонадотропного гормона. PLoS ONE 4 (9): e7244. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244

Редактор: Винсент Лауде, Высшая нормальная школа Лиона, Франция

Поступила: 7 апреля 2009 г .; Одобрена: 19 августа 2009 г .; Опубликован: 29 сентября 2009 г.

Авторские права: © 2009 Lim et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана Советом по биомедицинским исследованиям (звездочка A *). S.L. является получателем стипендии для выпускников A * star. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Гонадотропины гипофиза, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ) играют разные роли в регулировании развития и функции гонад и, таким образом, проявляют различную временную экспрессию, хотя оба гормона производятся в одной и той же клетке и их биосинтез. регулируется тем же гонадотропин-рилизинг-гормоном (GnRH).Гормоны гонадотропина являются гетеродимерами: α-субъединица (αGSU) является общей для обоих гормонов, тогда как β-субъединица уникальна и придает биологическую специфичность. Дифференциальная экспрессия гена β-субъединицы регулируется разной частотой импульсов GnRH: увеличение частоты импульсов стимулирует экспрессию гена LHβ, а ее снижение приводит к снижению LHβ, но увеличению экспрессии FSHβ; Экспрессия αGSU регулируется менее строго и стимулируется постоянным или высокочастотным введением гонадолиберина [1] — [4].Механизмы, с помощью которых клетка способна декодировать различные частоты GnRH и транслировать их в дифференциальную экспрессию генов субъединиц, еще предстоит выяснить [5].

Предыдущие исследования предложили десенсибилизацию рецептора в качестве основного средства различения частот импульсов GnRH, даже несмотря на то, что GnRH-рецептор млекопитающих (GnRH-R) является атипичным рецептором, связанным с G-белком, который не имеет карбоксильного концевого домена, и таким образом, проявляется медленная интернализация и отсутствие быстрой десенсибилизации [6] — [9].Однако сообщалось о корреляции между концентрацией GnRH-рецептора (GnRH-R) и оптимальными уровнями экспрессии гена субъединицы гонадотропина при различных частотах импульсов GnRH [10], [11]. Концентрации рецепторов после 20-часового воздействия GnRH были самыми высокими для промежуточных импульсов GnRH (1 импульс / 30 мин), что совпадало с высокими уровнями активности промотора αGSU, LHβ и GnRH-R, в то время как самые высокие уровни активности промотора FSHβ наблюдались при более низких концентрациях рецептора при более медленном движении. Частоты ГнРГ (1 импульс / 2 ч; [12], [13]).Было показано прямое действие GnRH на транскрипцию GnRH-R [11], [14]. Следовательно, возможно, что GnRH по-разному регулирует гены субъединиц гонадотропина, контролируя экспрессию гена GnRH-R и концентрацию рецепторов на клеточной поверхности, что может влиять на последующие события передачи сигналов.

При связывании GnRH-R, GnRH запускает каскад событий, приводящих к активации трех основных каскадов митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK): киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK) 1/2, c-Jun Nh3-концевой киназы (JNK) и стр.В результате их фосфорилирования ERK1 / 2 активируется примерно в 12 раз, JNK в 20-50 раз и p38 примерно в 2 раза [15]. Три гена субъединиц гонадотропина активируются различными комбинациями этих путей MAPK: в то время как все три гена субъединиц требуют активированного (p) ERK1 / 2 для активации транскрипции, LHβ также требует pJNK, тогда как FSHβ требует всех трех путей MAPK; pJNK также нацелен на экспрессию гена GnRH-R [14], [16] — [18]. Четвертый MAPK, Big MAPK (BMK) или ERK5, также активируется GnRH, но мало известно о его влиянии на экспрессию гена субъединицы гонадотропина [15].Ранее мы показали, что GnRH-активируемая регуляция экспрессии FSHβ включает Nur77 и MEF2, оба из которых активируются ERK5 в Т-клетках [19], [20]. Следовательно, возможно, что ERK5 также участвует в дифференциальной экспрессии генов субъединиц гонадотропина, специфически регулируя транскрипцию FSHβ посредством Nur77 и MEF2D. Интересно, что Nur77 снижает экспрессию гена GnRH-R [14], [21], повышая вероятность того, что он также участвует в частотном декодировании, регулируя количество GnRH-R.

Одновременно с активацией GnRH ERK1 / 2, JNK и p38 их специфические MAPK фосфатазы (MKP), фосфатазы с двойной специфичностью (DUSP) 1 и 4 также подвергаются повышенной регуляции [22]. Они дефосфорилируют остатки треонина и тирозина на MAPK, делая MAPK неактивными [23]. PMAPK усиливают активацию транскрипции и стабилизацию белка DUSP, обеспечивая отрицательную обратную связь, которая точно настраивается индивидуальными предпочтениями каждого DUSP в отношении конкретной MAPK [23].

Зависимость экспрессии гена субъединицы гонадотропина от MAPKs имеет два вероятных следствия для механизма частотного декодирования GnRH: во-первых, дифференциальная зависимость трех генов субъединиц от различных комбинаций pMAPKs может вносить вклад в частотное декодирование GnRH. ΑGSU, активация которого зависит только от pERK1 / 2, может оптимально экспрессироваться на частотах GnRH, при которых только ERK1 / 2, но не JNK или p38, сильно активируются. С другой стороны, гены, требующие более одной или двух pMAPK, будут оптимально экспрессироваться только на частотах, при которых все необходимые MAPK активируются одновременно на самых высоких уровнях.Такая синхронизация активации MAPK может быть продиктована частотой GnRH и обеспечивает разумную связь между частотой GnRH и дифференциальной экспрессией гена субъединицы.

Во-вторых, пороговое значение активности MAPK было предложено как возможный механизм дифференциальной активации генов [5]. Как αGSU, так и FSHβ сильно зависят от pERK1 / 2 для активации транскрипции; это инактивируется DUSP1, который также активируется GnRH [22]. Следовательно, более высокие частоты GnRH могут препятствовать достижению уровня активной pERK1 / 2 порога, необходимого для индукции экспрессии гена FSHβ, хотя этого может быть достаточно для экспрессии αGSU.Учитывая, что более медленные импульсы GnRH будут приводить к меньшей активности DUSP1, это позволит накопить достаточное количество pERK1 / 2 для прохождения порогового уровня [5]. Уровень порога будет зависеть от количества отрицательной обратной связи каждого MKP по отношению к его конкретному MAPK, а частота импульсов GnRH будет регулировать активность MAPK путем настройки степени отрицательной обратной связи, тем самым позволяя отрицательной обратной связи формировать основу частоты -декодирование.

На сегодняшний день различные экспериментальные подходы, используемые для выяснения молекулярных механизмов частотного декодирования GnRH гонадотропом, дали лишь частичное объяснение (например,грамм. [5], [13], [24] — [26]). Было высказано предположение, что отрицательная обратная связь участвует после того, как несколько генов, кодирующих различные факторы, которые, как известно, действуют как негативные регуляторы GnRH-активируемых путей, были увеличены после воздействия GnRH [8], [27], [28]. Хотя были предложены ключевые сетевые функции, которые могут помочь в частотном декодировании, концептуальные модели и частичные экспериментальные данные, предыдущие исследования не смогли расширить их результаты, чтобы продемонстрировать, как они объясняют дифференциальную экспрессию трех субъединичных генов.

Целью данного исследования было выяснить механизм частотного декодирования с использованием вычислительных и экспериментальных методов. Первоначально мы использовали математическое моделирование и компьютерное моделирование, чтобы проверить возможность того, что MKP-отрицательная обратная связь в сочетании с дифференциальной зависимостью трех субъединичных генов от различных комбинаций pERK1 / 2, pJNK и pp38 составляет основу частотного декодирования GnRH. импульсы. Это также позволило нам количественно продемонстрировать пороговое значение активности MAPK и определить его в математических терминах.Затем мы экспериментально исследовали роль ERK5 в регуляции экспрессии гена FSHβ и затем смогли дополнить нашу математическую модель экспериментальными данными. Наконец, динамика рецепторов была включена в модель, чтобы прояснить роль концентрации рецепторов в регуляции дифференциальной экспрессии генов субъединиц.

Результаты

Отрицательная обратная связь MKP вызывает частотно-зависимую дифференциальную экспрессию гена субъединицы гонадотропина

Чтобы изучить возможность того, что негативная регуляция MAPK их специфическими фосфатазами играет роль в частотном декодировании импульсов гонадолиберина, чтобы обеспечить дифференциальную экспрессию гена субъединицы гонадотропина, мы построили базовую модель, которая воспроизводила дифференциальную зависимость каждой субъединицы. на известные комбинации pERK1 / 2, pJNK и pp38, которые включают также MKP, которые они активируют и против которых действуют эти MKP.Компьютерное моделирование этой базовой модели проводилось с использованием пульсирующего профиля для активации MAPKK (рис. 1A). Каждое моделирование длилось 1440 минут времени моделирования.

Рис. 1. Фосфатазная обратная связь приводит к дифференциальной экспрессии генов.

(A) Пульсирующий профиль импульсов для активации MAPKK, используемый при моделировании моделей. Импульс нарастает в течение 5 минут синусоидальным образом, чтобы достичь своего максимального значения, прежде чем подвергнуться экспоненциальному затуханию. (B) Базовая модель без отрицательной обратной связи, где уровни DUSP1 и 4 поддерживались постоянными, моделировалась в течение 1440 мин для пяти различных частот импульсов стимула pMAPKK: 8 мин, 30 мин, 60 мин, 120 мин и 240 мин.В конце каждого моделирования были отмечены общие накопленные концентрации субъединиц αGSU, LHβ и FSHβ и нанесены на график как кратные различия по самой низкой концентрации для каждой субъединицы среди пяти тестируемых частот. (C) Базовая модель, в которой уровни DUSP1 и 4 могут активно индуцироваться pERK1 / 2 и pJNK, была смоделирована, и графики построены, как в (B).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.g001

Базовая модель была запущена на пяти различных частотах: 8, 30, 60, 120 и 240 минут, которые отражают физиологически релевантные частоты пульса GnRH и включают те, которые использовались в предыдущих исследованиях [2], [13], [29], что позволяет сравнивать их с результатами моделирования.Сначала мы провели моделирование базовой модели для каждой из вышеуказанных частот, чтобы получить минимальные среднеквадратичные (среднеквадратичные) значения DUSP1 и 4 как меры средней активации этих фосфатаз. Затем мы заменили начальные концентрации этих фосфатаз их минимальными среднеквадратичными значениями и заново определили их уравнения, чтобы поддерживать их при этих концентрациях на протяжении всего моделирования. Это предотвратило их активацию какой-либо киназой и, следовательно, любой потенциальной отрицательной обратной связью против активирующей киназы.Кроме того, мы выбрали минимальные среднеквадратичные значения, чтобы на самых низких частотах, при которых скорость активации MAPK самая низкая, уровни MKP не были настолько высокими, чтобы чрезмерно подавлять активность MAPK.

Моделирование показало, что для всех трех субъединиц наивысшие уровни экспрессии были получены с 8-минутными импульсами, и эти уровни постепенно снижались с уменьшением частоты стимулов (рис. 1B), что указывает на отсутствие дифференциальной экспрессии генов. Когда исходные уравнения скорости, управляющие DUSP1 и 4, вместе с их предыдущими исходными концентрациями были восстановлены, наивысшие уровни экспрессии α-субъединицы были получены для 8-минутных импульсов, для LHβ при 60-минутных импульсах и для FSHβ при 120-минутных импульсах (рис. 1C). ).Это демонстрирует, что отрицательная обратная связь со стороны фосфатаз имеет решающее значение для дифференциальной экспрессии генов субъединиц гонадотропина.

Чтобы определить, является ли модель надежной и уникальны ли полученные положительные результаты для одного набора значений параметров, был проведен анализ чувствительности. Каждый кинетический параметр был скорректирован на 10% от его первоначального значения, и тенденции экспрессии субъединицы гонадотропина с различными частотами были отмечены, как и раньше. Различная дифференциальная экспрессия генов поддерживалась на протяжении всех изменений каждой из кинетических констант, нарушенных для базовой модели с обратной связью.Точно так же отсутствие дифференциальной экспрессии генов наблюдалось для всех вариаций каждой кинетической константы для модели без обратной связи (дополнительный рисунок S1).

Дифференциальная экспрессия генов возникает в результате индуцированного фосфатазой увеличения средней активации MAPK с уменьшением частоты стимула

Поскольку отрицательная обратная связь по MAPK кажется критической для дифференциальной экспрессии генов, мы исследовали природу эффектов этих фосфатаз на pMAPK.Для этого мы смотрели на максимальную амплитуду, среднеквадратичное значение и общее количество активированной киназы для каждого pMAPK. Затем были нанесены кратные различия для каждой из этих величин для каждого pMAPK.

В отсутствие отрицательной обратной связи максимальная амплитуда была одинаковой для всех частот для каждого pMAPK (рис. 2A). С другой стороны, среднеквадратичные значения постепенно снижались с уменьшением частоты (рисунок 2B). Общее количество активированной киназы за 1440 мин времени моделирования резко упало с уменьшением частоты (рис. 2С).Хотя при наличии отрицательной обратной связи также наблюдалось устойчивое снижение общего количества активированной киназы, это было не так резко, как при отсутствии отрицательной обратной связи (рис. 2С). Более того, как максимальная амплитуда, так и среднеквадратичное значение для каждой активированной киназы неуклонно увеличивались с уменьшением частоты (рисунки 2A и B). Эти результаты предполагают, что дифференциальная экспрессия генов требует увеличения среднеквадратичного значения с уменьшением частоты GnRH, вызванного отрицательной обратной связью со стороны фосфатаз.

Рисунок 2. Анализ активации MAPK для базовой модели.

Базовая модель с фосфатазной обратной связью и без нее была смоделирована, как показано на рисунке 1. В конце каждого моделирования (A) максимальные установившиеся амплитуды, (B) среднеквадратичные (среднеквадратичные) значения и (C) вычисляли общие концентрации каждого активированного (p) MAPK. Эти значения были нанесены на график как кратные различия по сравнению с соответствующими значениями для частоты импульсов 8 мин.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0007244.g002

GnRH активирует ERK5, который стимулирует FSHβ и подавляет экспрессию гена GnRH-R

На основании сообщений о том, что ERK5 активирует Nur77 в Т-клетках [19], и наших выводов о том, что Nur77 играет решающую роль в экспрессии гена FSHβ [20], мы исследовали роль ERK5 в активации транскрипции FSHβ. Сначала мы провели динамический анализ активации ERK5 под действием гонадолиберина с помощью вестерн-анализа лизатов целых клеток гонадотропных клеток LβT2, обработанных 100 нМ GnRH в течение 0–120 мин.Уровень фосфорилированного ERK5 (pERK5) явно увеличивался в течение 5 минут после лечения GnRH, достигая пика через 30–60 минут, и повышенные уровни все еще обнаруживались через 90–120 минут (Рисунок 3A).

Рисунок 3. GnRH увеличивает экспрессию гена FSHβ за счет активации ERK5.

(A) Клетки LβT2 культивировали и подвергали действию GnRH в течение 0–2 часов перед лизисом и вестерн-анализом с использованием антисыворотки pERK5 (верхняя панель) или общего ERK5 (нижняя панель). (B) Конструкция мышиного FSHβ-luc (200 нг) и векторы экспрессии ERK5 или конститутивно-активные MEK5 (D) или оба (50 нг каждый) трансфицировали в клетки αT3-1 в 96-луночных планшетах.Уровни люциферазы были нормализованы к уровням Renilla, и результаты показывают кратность индукции по сравнению с необработанными клетками, трансфицированными контролем FSHβ-luc. Среднее значение ± SEM, n = 6. Средние значения сравниваются с помощью ANOVA с последующим t-критерием Бонферрони; несущественно различающиеся (p> 0,05) обозначены одной и той же буквой. (C) Клетки культивировали в 6-луночных планшетах и трансфицировали 2 мкг экспрессионных векторов ERK5 или MEK5 (D) или обоими; через 48 ч РНК экстрагировали для ОТ-ПЦР. Праймеры амплифицировали 856 п.н. FSHβ, 200 п.н. GnRH-R или 200 п.н. кДНК β-актина в качестве контроля.Ампликоны обрабатывали на агарозном геле, количественно определяли денситометрическим анализом, значения нормализовали по отношению к значениям β-актина и наносили кратные различия по сравнению с контрольными клетками. Среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 3. Статистический анализ (как на рисунке 3B) проводили отдельно для FSHβ (верхний регистр) или GnRH-R (нижний регистр). (D) Клетки LβT2 в 60-миллиметровых планшетах трансфицировали 4 мкг доминантно-отрицательной конструкции MEK5 (A) за 24 часа до обработки GnRH в течение 8 часов. РНК экстрагировали для ОТ-ПЦР; праймеры амплифицировали первые 225 п.н. FSHβ или 230 п.н. кДНК GAPDH в качестве контроля.(E) Точно так же клетки трансфицировали конструкцией MEK5 (A) перед обработкой GnRH в течение 3 или 8 часов, после чего РНК экстрагировали, подвергали обратной транскрипции и праймеры амплифицировали фрагмент кДНК GnRH-R или GAPDH, как контроль. Отмечено соотношение ампликона GnRH-R после нормализации с помощью GAPDH относительно уровней в необработанных образцах (с или без MEK5 (A).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.g003

Установив, что GnRH активирует ERK5, мы провели анализ активности промотора, чтобы определить, способен ли ERK5 увеличивать активность промотора FSHβ.Векторы экспрессии для ERK5 и его активирующей киназы MEK5 (D) трансфицировали либо по отдельности, либо вместе, и измеряли эффекты на репортерную конструкцию промотор FSHβ мыши и люциферазы. Трансфекция только экспрессионных векторов ERK5 или MEK5 (D) индуцировала активность промотора FSHβ в 7–9 раз, что указывает на некоторую базальную активность MEK5 в этих клетках, возможно, из-за факторов в сыворотке. Однако сверхэкспрессия обоих факторов вместе вызвала активность почти в 14 раз по сравнению с уровнями в необработанных клетках (рис. 3В).

Способность pERK5 влиять на транскрипцию FSHβ была подтверждена с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР. Изменения в уровнях мРНК GnRH-R также измеряли для оценки возможности того, что изменение экспрессии GnRH-R также включает механизм для индуцированной GnRH и ERK5 экспрессии гена FSHβ. Сама по себе ERK5 не влияла на уровни мРНК FSHβ, что указывает на отсутствие базовой активации пути в этих условиях, но она дополнительно усиливала эффект MEK5 (D). Все виды лечения незначительно снижали уровни мРНК GnRH-R, предполагая, что GnRH может действовать через этот путь, подавляя свой собственный рецептор (рис. 3C).

Чтобы проверить, действительно ли эффект GnRH на транскрипцию гена FSHβ происходит через активацию ERK5, за 24 часа до лечения GnRH, конструкция MEK5 (A), которая кодирует доминантно-отрицательный MEK5, была трансфицирована для предотвращения активации ERK5. Анализ RT-PCR показал, что стимулирующее действие GnRH на уровни транскрипта FSHβ практически исчезло после репрессии активации ERK5 (фигура 3D). Точно так же роль ERK5 в подавлении GnRH GnRH-R была протестирована путем трансфекции конструкции MEK5 (A) с последующим 3 или 8-часовым воздействием GnRH.После 3-часовой экспозиции GnRH уровни мРНК GnRH-R были повышены, но они вернулись к базовым уровням к 8-часовой экспозиции. Однако в клетках, трансфицированных MEK5 (A), падение через 8 ч явно уменьшилось (рис. 3E).

pERK5 увеличивает уровни экспрессии FSHβ в зависимости от концентрации

Показав, что pERK5 увеличивает экспрессию гена FSHβ, мы добавили этот эффект к нашей базовой модели с фосфатазной обратной связью, чтобы сформировать расширенную модель. Моделирование этой модели снова показало дифференциальную экспрессию гена субъединицы.ΑGSU предпочтительно экспрессировался с частотой следования импульсов 8 мин, LHβ — через 60 мин, а FSHβ — через 120 мин (фигура 4A), что было подтверждено в анализе чувствительности (дополнительная фигура S2). Примечательно, что максимальная кратная индукция FSHβ была больше для расширенной модели по сравнению с базовой моделью (рис. 4A и рис. 1C), что указывает на то, что компонент pERK5 в этой модели повышает уровни FSHβ с уменьшением частоты импульсов GnRH. Относительные концентрации различных киназ, использованные в модели, означают, что концентрация ERK5 была лимитирующим фактором, который ограничивал степень увеличения уровней мРНК FSHβ.

Рисунок 4. Расширенная модель с фосфатазной обратной связью демонстрирует дифференциальную экспрессию генов, которая усиливается ERK5.

(A) Расширенная модель по умолчанию с обратной связью по фосфатазе моделировалась в течение 1440 минут для тех же пяти частот, и тренды экспрессии для каждой субъединицы были нанесены на график, как показано на рисунке 1. После этого (B) максимальная стационарная амплитуда, (C ) среднеквадратичное значение и (D) общая концентрация активированного ERK5 были вычислены и нанесены на график. (E) Расширенная модель затем была повторно смоделирована с различными концентрациями общего ERK5 (50, 100 или 150 нМ), и были построены тренды экспрессии FSHβ.(F) Чтобы проверить эти модели, максимальная амплитуда pERK5 была измерена в клетках после введения 5-минутных импульсов GnRH на отмеченных частотах в течение 4 часов. Белок собирали через 0–90 мин после последнего импульса и анализировали вместе с внутренним стандартом для сравнения с помощью вестерн-блоттинга на pERK5 и общий ERK5. Максимальная амплитуда для каждой частоты импульсов показана после нормализации к общим уровням ERK и внутреннему стандарту. На нижней панели также показаны уровни мРНК FSHβ после последнего импульса.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.g004

Максимальная амплитуда активированного ERK5 увеличивалась с уменьшением частоты GnRH, как и ранее (Рисунок 4B). Среднеквадратичное значение для pERK5 было самым высоким при 8-минутной частоте импульсов, но немного снизилось при 30-минутных импульсах (рис. 4C). Однако затем он увеличивался с уменьшением частот, чтобы достичь уровня, близкого к уровню 8-минутной частоты импульсов. Как и в случае с другими MAPK, общее количество активированного ERK5 в течение 1440 мин времени моделирования уменьшалось с более низкими частотами GnRH (рис. 4D).

Мы протестировали эту расширенную модель с различными концентрациями общего ERK5 (50, 100 и 150 нМ) с 50 нМ в качестве основы для сравнения. Результаты моделирования показали, что индукция FSHβ увеличивается с увеличением концентрации ERK5 (фиг. 4E), подтверждая, что концентрация ERK5 была ограничивающим фактором в ответе FSHβ. Следовательно, ERK5 оказывает отчетливое действие на усиление экспрессии FSHβ, сохраняя при этом его предпочтительную низкую частоту импульсов стимула для оптимальной экспрессии.

Наконец, мы подтвердили влияние частоты пульса GnRH на ERK5, исследуя максимальную амплитуду pERK5 после введения GnRH с различной частотой импульсов и измеряя уровни белка в течение следующих 90 минут. Максимальный уровень pERK5, рассчитанный относительно общего ERK5 и нормализованный по уровням эталонного образца, был значительно выше в клетках, получавших импульсы с интервалами 120 мин, чем в клетках, получавших импульсы с интервалами 30 мин (1,52 ± 0,06 раза, n = 3; р <0,05). Это совпало с индукцией уровней мРНК FSHβ, которая была максимальной после 120-минутного интервала импульсов (рис. 4F).

Дифференциальная концентрация GnRH-R сама по себе, по-видимому, не вызывает полной дифференциальной экспрессии гена субъединицы гонадотропина

Учитывая, что ранее сообщалось, что концентрация GnRH-R на клеточной поверхности коррелирует с дифференциальной экспрессией генов субъединиц гонадотропина [13], мы исследовали, будут ли различия в GnRH-R при различных частотах импульсов GnRH достаточными для возникновения дифференциальной субъединицы экспрессия гена. Для этого модель была дополнительно расширена, чтобы включить динамику GnRH-R.Поскольку сообщается, что JNK активирует уровни GnRH-R [14], а ERK5, вероятно, подавляет экспрессию GnRH-R посредством Nur77 (Рисунки 3C, 3E и [21]), были введены два настраиваемых параметра, ε и γ, чтобы позволить Мы наблюдаем влияние как pJNK, так и pERK5 на частотное декодирование посредством регулирования уровней GnRH-R.

Модель была смоделирована, во-первых, без синтеза или деградации рецепторов, чтобы оценить влияние различных концентраций рецепторов на экспрессию гена субъединицы.Для каждой частоты импульсов в исходную концентрацию свободного рецептора, R, вносили изменения до коэффициента, умноженного на базальное значение 0,01 нМ, в соответствии с описанной кратной стимуляцией активности промотора GnRH-R [13]. Следовательно, для 8-минутных импульсов эта начальная концентрация будет 0,016 нМ, для 30-минутных импульсов 0,018 нМ, для 60-минутных импульсов 0,019 нМ, для 120-минутных импульсов 0,015 нМ и для 240-минутных импульсов 0,01 нМ.

Результаты моделирования показали, что общая концентрация GnRH-R накопилась за 1440 мин, что согласуется с опубликованными данными [13].Однако, в то время как αGSU экспрессировалась на почти одинаково высоких уровнях в течение 8–30-минутных импульсов, обе β-субъединицы имели пик экспрессии при 60-минутной частоте импульсов (Рисунок 5A). После изучения среднеквадратичных значений pMAPK они неуклонно увеличивались с уменьшающейся частотой до 60 мин, после чего они уменьшались (Рисунок 5B) из-за наложенных начальных условий, в которых при моделировании модели присутствовали более низкие концентрации GnRH-R. при частоте пульса GnRH 120 и 240 мин. Наконец, общая активация MAPK уменьшалась с уменьшением частоты, как и раньше (данные не показаны).

Фигура 5. Дифференциальная концентрация GnRH-R сама по себе не вызывает полной дифференциальной экспрессии гена субъединицы гонадотропина.

Модель с усилением рецепторов моделировалась в течение 1440 мин, при этом общая концентрация рецепторов оставалась постоянной. Для каждой частоты импульсов начальная концентрация свободного рецептора R была изменена на коэффициент, умноженный на базальное значение 0,01 нМ, в соответствии с кратностью стимуляции активности промотора GnRH-R, как сообщается в литературе [13] .(A) Затем были рассчитаны кратные различия для экспрессии каждой субъединицы, а также для GnRH-R и нанесены на график, как на рисунке 1B. (B) Были вычислены и нанесены на график разности кратности среднеквадратичного значения каждого активированного MAPK.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.g005

JNK-положительная прямая связь без ERK5-отрицательной обратной связи по экспрессии GnRH-R вызывает потерю дифференциальной экспрессии гена субъединицы гонадотропина

Роль JNK-позитивной прямой связи на экспрессию GnRH-R была исследована на полной модели путем введения синтеза и деградации рецептора, а не искусственного установления начальной концентрации R для каждой частоты GnRH.Установка ε = 1 и γ = 0, чтобы была разрешена только прямая связь JNK, привела к полной потере дифференциальной экспрессии генов с экспоненциальными импульсами (рис. 6A). И это несмотря на то, что модель дает правильные тенденции экспрессии GnRH-R (рис. 6A, сравните с рис. 5A).

Рисунок 6. JNK-положительная прямая связь без ERK5-отрицательной обратной связи по экспрессии GnRH-R приводит к потере дифференциальной экспрессии генов.

Модель, усиленная рецепторами, моделировалась в течение 1440 мин. Модель была установлена с ε = 1 и γ = 0, так что система была лишена ERK5-негативной регуляции уровней экспрессии GnRH-R.После этого были нанесены (A) тренды экспрессии каждой субъединицы и GnRH-R, (B) среднеквадратичные значения и (C) общая концентрация каждого pMAPK.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.g006

Чтобы понять возможные причины этой потери дифференциальной экспрессии генов, были исследованы как среднеквадратичные значения, так и общая активация всех pMAPK. В отличие от предыдущего, оба эти значения уменьшались одновременно с уменьшением частоты пульсирующего стимула (рисунки 6B, 6C).Таким образом, оказывается, что хотя JNK-прямая связь может увеличивать уровни GnRH-R на более низких частотах, она также косвенно увеличивает уровни DUSP1 и 4 за счет большей активации MAPK в результате повышенной концентрации рецепторов, таким образом, средние уровни (как показано среднеквадратичные значения) активации MAPK соответственно уменьшаются. Следовательно, хотя существует корреляция между концентрацией рецепторов и дифференциальной экспрессией генов субъединиц, это явно не прямая причинная связь.

ERK5-отрицательная обратная связь против экспрессии GnRH-R восстанавливает дифференциальную экспрессию гена субъединицы гонадотропина в полной модели

Установив, что JNK-прямая связь на GnRH-R отменяет дифференциальную экспрессию гена субъединицы, настройки параметров были изменены на ε = 0 и γ = 1, чтобы исследовать влияние ERK5-отрицательной обратной связи на GnRH-R.Эта отрицательная обратная связь была предположена на основании более раннего открытия, что сверхэкспрессия ERK5 снижает уровни мРНК GnRH-R (Фигуры 3C, 3E), а также сообщения о том, что Nur77, который активируется GnRH в незрелых гонадотропах и ERK5 в Т-клетках. , подавляет экспрессию GnRH-R [19] — [21]. Моделирование модели с этими настройками параметров восстановило дифференциальную экспрессию генов (рис. 7A). Кроме того, даже несмотря на то, что увеличение среднеквадратичных значений pERK1 / 2, pJNK и pp38 с уменьшением частоты было менее резким, снижение общей активации MAPK также уменьшалось менее резко по частотам (Рисунки 7B, 7C), так что FSHβ достиг пика 5. .Индукция в 5 раз выше, чем в базовой или промежуточной моделях. Это говорит о том, что с обратной связью против GnRH-R посредством ERK5, наблюдается усиление дифференциального эффекта на экспрессию гена FSHβ. После этого как JNK-прямая обратная связь, так и ERK5-отрицательная обратная связь были объединены, установив как ε, так и γ = 1, и хотя пиковая кратная индукция FSHβ снизилась, наблюдалась явно дифференциальная экспрессия гена (фигура 7D). Как и прежде, был проведен анализ чувствительности, чтобы убедиться, что полная модель, полученная в результате включения новых кинетических констант и молекулярных видов в базовую и промежуточную модели, является надежной (дополнительные рисунки S3, S4, S5).

Рисунок 7. ERK5-отрицательная обратная связь по экспрессии GnRH-R восстанавливает дифференциальную экспрессию гена субъединицы гонадотропина.

Модель, усиленная рецепторами, моделировалась в течение 1440 мин для тех же пяти частот гонадолиберина, что и раньше. Модель была установлена с ε = 0 и γ = 1, так что система обладает ERK5-негативной регуляцией, но не JNK-позитивной регуляцией уровней экспрессии GnRH-R. После этого были нанесены (A) тренды экспрессии каждой субъединицы, (B) среднеквадратичные значения и (C) общая концентрация каждой pMAPK.(D) После этого модель была установлена с ε = 1 и γ = 1, так что система обладает как ERK5-негативной регуляцией, так и JNK-позитивной регуляцией уровней экспрессии GnRH-R.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.g007

Обсуждение

Способность гонадотропа гипофиза декодировать частоту импульсов гонадотропного гормона и дифференцированно регулировать экспрессию гена гонадотропина является важным регуляторным механизмом в репродуктивной физиологии и, учитывая обилие гормонов, секретируемых в пульсирующей манере, вероятно, представляет собой общий механизм в репродуктивной физиологии. регуляторная биология.В этом исследовании мы построили математическую модель, которая описывает основную архитектуру трех основных путей MAPK, активируемых GnRH, и использовали и усовершенствовали ее на основе оригинальных и опубликованных экспериментальных данных, чтобы предложить механизм частотного декодирования. Ключевым моментом для дифференциальной активации генов в этой модели является отрицательная обратная связь на MAPK со стороны их специфических MKP (Рисунок 8).

Рисунок 8. Схематическое изображение используемых моделей.

Показаны основные (A), (B) промежуточные и (C) полные модели, используемые при изучении влияния различных обратных связей на декодирование частот импульсов GnRH для дифференциальной экспрессии гена субъединицы гонадотропина.Стрелки указывают активацию (в случае ферментативных реакций) или индукцию (в случае генов). Точно так же штрихи указывают на деактивацию (ферментативные реакции) или репрессию (экспрессия генов).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.g008

Отрицательная обратная связь, направляемая MKP, делает максимальные амплитуды и среднеквадратичные значения каждого pMAPK чувствительными к изменениям частоты импульсов GnRH. Причину первого можно объяснить уравнениями модели, где динамика каждого MAPK определяется двумя факторами: индукцией с помощью pMAPKK и дефосфорилированием его активной формы с помощью MKP.Концентрация pMAPKK с параметрами нашей модели и начальными концентрациями всегда достигает пика 50 нМ с каждым импульсом, так что для каждого цикла он активирует MAPK до аналогичного максимума независимо от частоты. С другой стороны, активация MKP зависит от его активирующих pMAPK, концентрации которых колеблются в зависимости от частоты и времени, где более высокие частоты стимула означают большее количество pMAPK. Следовательно, максимальная активация MAPK зависит от частоты, и это подтверждается экспериментально [25].Точно так же среднеквадратичное значение каждого pMAPK также чувствительно к частоте из-за его зависимости как от максимальной достигнутой амплитуды активации MAPK, так и от частоты стимула, поскольку он включает в себя непосредственное вычисление площади под кривой, изображающей общую активацию MAPK. Это заставляет нас поддержать теорию частотного декодирования, основанную на пороговой обработке активности MAPK [5].

Чтобы определить эти пороги, уравнения скорости, управляющие синтезом мРНК каждой субъединицы гонадотропина, могут быть обобщены следующим образом: где i = 1 для α-субъединицы, i = 2 для LHβ и i = 3 для FSHβ (= 4 для расширенных моделей ).Такое использование транскрипционной логики уже успешно применялось для прокариотических систем и, вероятно, справедливо для эукариотических систем [30]. Используя многомерный дифференциальный расчет, мы можем определить критический набор концентраций компонента pMAPKs, который приводит к максимальной скорости синтеза мРНК. Непрерывность этих функций скорости затем подразумевает наличие порогового набора концентраций ниже этого критического набора, выше которого скорость синтеза остается на заранее определенном уровне.Частотное декодирование возникает из выделения частот, которые могут вызывать активацию компонентных MAPK, последовательно превышающих этот порог. Частоты, которые вызывают самую высокую среднеквадратичную (среднюю) активацию и пиковую активацию компонентов MAPK, являются оптимальными для экспрессии гена субъединицы. Это очевидно для FSHβ на низких частотах GnRH, где отрицательная обратная связь способствует высоким среднеквадратичным и пиковым значениям активации на этих частотах. С другой стороны, высокие частоты GnRH способствуют синтезу мРНК αGSU, по-видимому, потому, что общее количество активации ERK1 / 2, достигаемое с этими частотами, перевешивает менее значительное снижение как среднеквадратичной, так и пиковой активации.Следовательно, кажется, что чем больше количество зависимостей MAPK, тем важнее роль среднеквадратичной и пиковой активации и, следовательно, отрицательной обратной связи.

Пороговое значение и его роль в определении регуляции генов были широко изучены в биологии развития, особенно в контексте формирования паттерна. Во время развития клетки, которые принципиально идентичны и различаются только своим расположением по отношению к стимулятору, по-разному реагируют на изменяющуюся концентрацию стимулятора, тем самым обеспечивая зависящие от концентрации и положения ответы на морфогены для соответствующего перепрограммирования транскрипции для достижения правильного эффекта. видообразование [31] — [34].Также в ферментативных каскадах пороги, вместе с отрицательной обратной связью, были описаны как вызывающие задержки во времени, ведущие к митотическим колебаниям. Более того, механизм возникновения порогов был предложен в терминах феномена сверхчувствительности нулевого порядка, описанного для биохимических систем, регулируемых ковалентной модификацией [35]. Благодаря предложенной нами корреляции между скоростью синтеза мРНК субъединицы гонадотропина с концентрацией pMAPK сверхчувствительное поведение становится неотъемлемой частью продукта концентраций pMAPK, и чем выше количество зависимостей pMAPK, тем выше сверхчувствительность.

Механизм частотного декодирования в гонадотропе был дополнительно прояснен новым объяснением роли ERK5 в экспрессии FSHβ. Примечательно, что кинетика активации ERK5 с помощью GnRH подобна кинетике активации ERK1 / 2 [17], в то время как ее низкие уровни указывают на типичные количества pERK5 в этих клетках. Эти находки оправдывают включение ERK5 в нашу модель, чтобы проверить его роль в частотном декодировании GnRH. Кинетические константы и начальные концентрации, примененные к pERK5 в этой усовершенствованной модели, согласуются с нашими экспериментальными данными.Поскольку у нас мало информации о регуляции активности ERK5, в частности, о ее специфической фосфатазе и регуляции этой фосфатазы, мы гипотетически определили ERK5-специфическую фосфатазу (BMKSP), которая регулируется исключительно pERK5 и отвечает за негативно регулируют pERK5. Основываясь на том, как регулируются другие MAPKs, мы считаем весьма вероятным, что такая фосфатаза существует [23]. Таким образом, ERK5 отличается от других MAPK в наших моделях тем, что он регулируется автономно с помощью своей уникальной фосфатазы.ERK5-специфическая фосфатаза и, следовательно, сама ERK5, скорее всего, регулируются другими киназами, но не ERK1 / 2, JNK или p38 [23], [36]. Таким образом, автономность регулирования ERK5 в контексте наших моделей является допустимой.

Моделирование этой расширенной модели подтвердило, что с включением ERK5 и его фосфатазы поддерживается дифференциальная экспрессия генов. При наличии механизма обратной связи на всех четырех pMAPK максимальная амплитуда и среднеквадратичное значение pERK5 ведут себя так же, как и другие pMAPK (см.Рисунки 2 и 4), демонстрирующие соответствующее поведение обратной связи. Включение ERK5 и его индуктивное действие на FSHβ означает, что скорость синтеза мРНК FSHβ пропорциональна произведению концентраций четырех pMAPK. Это приводит к небольшому увеличению количества синтезируемой мРНК по сравнению с базовой моделью (в 4 раза против 3,5 раза) при 50 нМ ERK5. Увеличение невелико из-за разницы в один порядок величины между общей концентрацией ERK5 и остальными MAPK, что делает ее определяющим фактором.Сверхчувствительное поведение наблюдалось, когда мы запускали расширенную модель с другими значениями общей концентрации ERK5, которые были ближе к значениям других MAPK. Разница в разы увеличивалась с 4 до почти 6 раз, когда ERK5 был увеличен с 50 до 150 нМ. Следовательно, ERK5 увеличивает сверхчувствительное поведение экспрессии FSHβ и тем самым увеличивает его уровень экспрессии, а также стабилизирует его предпочтение низким частотам стимула. Более того, максимальная амплитуда pERK5, предсказанная моделью при более медленных частотах импульсов, была подтверждена экспериментально и совпадала с наибольшим увеличением уровней мРНК FSHβ (рис. 4F).

GnRH регуляция транскрипции GnRH-R, которая также зависит от частоты пульса GnRH, по крайней мере частично, осуществляется посредством JNK-опосредованной стимуляции и посредством Nur77-опосредованной репрессии [10], [11], [14], [21] . Это указывает на возможную роль JNK и ERK5, которые активируют Nur77 в других контекстах [19] и, как было замечено, снижают уровни мРНК GnRH-R (Рисунок 3D), а также в частотном декодировании сигналов GnRH. Продемонстрировав роль pERK5 в подавлении GnRH GnRH-R (рис. 3E), мы добавили этот эффект GnRH к модели.Первоначально, поддерживая общую концентрацию GnRH-R для каждой из частот импульсов на заявленных уровнях активности промотора GnRH-R [13], был обнаружен правильный профиль экспрессии GnRH-R, но была снижена дифференциальная экспрессия субъединичные гены (рис. 5).

Моделирование с JNK-индукцией, но без ERK5-ингибирования GnRH-R продемонстрировало соответствующий профиль экспрессии GnRH-R, но потерю дифференциальной экспрессии гена. Также наблюдалось снижение как среднеквадратичных значений, так и общей активации всех pMAPK с уменьшением частоты следования импульсов.Мы считаем вероятным, что JNK индуцирует GnRH-R при более низких частотах импульсов GnRH, но что последующее увеличение активности MAPK из-за повышенного количества рецепторов также увеличивает активность фосфатазы, что значительно снижает активность MAPK даже ниже базальных уровней. Однако введение pERK5 в эту модель восстановило дифференциальную экспрессию генов, даже несмотря на то, что активация ERK5 подавляет уровни экспрессии GnRH-R (рис. 3C, E). Это говорит о том, что pERK5 помогает модулировать JNK-индуцированное снижение активности MAPK, контролируя уровни GnRH-R, так что MAPK могут быть активированы способом, который позволяет частотное декодирование для дифференциальной экспрессии генов.Это, вероятно, включает дополнительную роль ERK5 в процессе частотного декодирования. Таким образом, оказывается, что, хотя уровни GnRH-R могут коррелировать с оптимальной экспрессией каждой из субъединиц [13], простое увеличение или уменьшение количества рецепторов может фактически не привести к полной дифференциальной экспрессии гена. Важно, чтобы эти колебания количества рецепторов контролировались определенными агентами (в данном случае pERK5 и pJNK) определенным образом (положительная прямая связь JNK, отрицательная обратная связь ERK5), чтобы рецепторы могли, в свою очередь, активировать MAPK соответствующим образом, чтобы включить дифференциальную экспрессию генов и частотное декодирование.

Пульсирующие стимулы и осциллирующие сигнальные посланники — общая черта, управляющая многими биологическими процессами (например, [37] — [39]). Выяснение механизмов, с помощью которых клетками декодируется пульсация сигналов, объясняет, как один и тот же стимулятор может приводить к различным результатам в одной клетке. В этом исследовании мы использовали модульный подход, чтобы создать модель передачи сигналов в гонадотропной клетке, которая является вычислительно точной из-за ее основы в экспериментальных данных.Этот подход, вероятно, будет более точным, чем попытка включить информацию обо всей сети, большая часть которой не имеет отношения к делу и, вероятно, неточна из-за большого количества кинетических параметров, которые необходимо оценить [40] — [42]. Наша модель предсказывает решающую роль обратной связи MKP и включает также новую роль ERK5, которая, как мы показали экспериментально, имеет значение, в то время как изменяющееся количество GnRH-R на поверхности клетки, по-видимому, менее значимо при частотном декодировании.Хотя это важное открытие для понимания регуляции гонадотропа гипофиза в контексте репродуктивной физиологии, разрешение механизмов, участвующих в частотном декодировании, способствует более глубокому концептуальному пониманию механизмов, управляющих дифференциальной экспрессией генов в регуляторной биологии.

Материалы и методы

Клеточные культуры и трансфекции

Эксперименты проводили с мышиными гонадотропами αT3-1 и LβT2, которые культивировали и трансфицировали при 50-60% конфлюэнтности с использованием реагента для трансфекции GenePORTER 2 (Gene Therapy Systems, Сан-Диего, Калифорния), как описано ранее [43].Для анализа RT-PCR клетки LβT2 культивировали в диализованной FCS (Biological Industries, Bet HaEmek, Израиль), что оптимизировало ответ GnRH. При необходимости клетки подвергали воздействию 100 нМ GnRH (Busserelin; Sigma; растворенный в H ₂ O), который добавляли в объеме 0,1% культуральной среды. Экспрессионные конструкции ERK5, MEK5 (A) и MEK5 (D) (предоставленные Astar Winoto, Калифорнийский университет в Беркли) трансфицировали по 2 мкг на лунку в шестилуночных планшетах или 4 мкг на 60 мм планшет, и общее количество трансфицированной ДНК определяли. уравновешивается pWS.

Анализы репортерного гена проводили с использованием 600 п.н. проксимального промотора гена FSHβ мыши, слитого с геном люциферазы светлячка, как описано ранее [44]. Значения люциферазы светлячков были нормализованы к значениям люциферазы Renilla, которую котрансфицировали в качестве внутреннего контроля. Эксперименты проводились как минимум в трех отдельных случаях, и показаны репрезентативные результаты.

Экстракция РНК и ПЦР с обратной транскриптазой

РНК

экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), и общую РНК (5 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (Promega, Madison, WI) и праймеров олиго (dT) (5 мМ; Биолаборатории Новой Англии, Беверли, Массачусетс).ПЦР-амплификацию проводили с использованием праймеров, как указано в подписях к рисункам. Амплификация мышиного β-актина или GAPDH служила в качестве внутреннего контроля. Все образцы анализировали в двух экземплярах.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее [44], с использованием антисыворотки, нацеленной на фосфорилированный ERK5 (pERK5) и общий ERK (Cell Signaling Technology).

Вычислительное моделирование сети GnRH

Для моделирования общей топологии сигнальной сети, стимулированной GnRH-R, мы предполагаем, что каждая активирующая киназа, pMAPKK, имеет профиль активации, имитирующий профиль пульсирующего стимула GnRH, различающийся только по амплитуде.Мы также предполагаем, что вовлеченные фосфатазы действуют непосредственно на уровне MAPK, а не MAPKK [23], [36]. Каждая активирующая MAPKK действует на нефосфорилированную MAPK с образованием фосфорилированной (p) MAPK, которая впоследствии дефосфорилируется соответствующим MKP. Применяя кинетику Михаэлиса-Ментен первого порядка с числами оборота kcat ₁ и kcat ₋₁ и константами Михаэлиса, km ₁ и km ₋₁, мы можем представить это как: где ([MAPK] — [ pMAPK]) обозначает количество нефосфорилированного MAPK, остающегося в любой момент времени.Все значения kcat ₁, km ₁, kcat ₋₁ и km ₋₁ были адаптированы из базы данных количественной сотовой сигнализации (DOQCS) [45] в качестве основных кинетических констант для фосфорилирование и дефосфорилирование ERK, и они представлены в дополнительном файле S1 и в дополнительных таблицах S1, S2, S3, S4.

Фосфатазы активируются соответствующими киназами, как описано в литературе, и это выражается в простых пропорциях этих киназ.Базовая скорость активации DUSP1 была взята из DOQCS. Более того, поскольку индукция DUSP4 намного медленнее по сравнению с DUSP1 [22], скорость индукции DUSP4 с помощью ERK1 / 2 снижается до 20% по сравнению с DUSP1. Их разложение пропорционально их мгновенным количествам. Это дает:

Скорость изменения количеств мРНК каждой субъединицы гонадотропина сделана пропорциональной произведению количеств их необходимых pMAPK. Это позволит нам проверить, действительно ли частоты GnRH синхронизируют периоды максимальной активности для различных MAPK для оптимальной экспрессии субъединиц.Если это не так, и эти MAPK активируются асинхронно, то результат их количества будет оставаться относительно стабильным со временем без значительного пика. Следствием этого будет отсутствие уникальных частотных режимов, в которых каждая субъединица гонадотропина экспрессируется оптимально. Таким образом, мы имеем: где и выбраны произвольно, без какого-либо вредного воздействия на общее поведение каждого гена субъединицы гонадотропина. Таким образом, приведенные выше уравнения образуют базовую модель.

Чтобы расширить базовую модель, мы добавляем уравнения, управляющие фосфорилированием и дефосфорилированием ERK5 его специфической фосфатазой, и модифицируем выражение для FSHβ, чтобы включить ERK5: where было изменено, чтобы соответствовать четвертой переменной.

Профиль активации MAPKK, используемый в качестве стимула для модели, представляет собой импульс, который достигает пика через 5 минут синусоидальным образом, за которым следует экспоненциальное затухание со скоростью κ для длительности между импульсами, продиктованной частотой импульсов GnRH.

Для включения динамики рецепторов использовалась опубликованная модель вплоть до составов для внутриклеточного кальция (CAC) [46]. Уравнение, регулирующее свободный GnRH-R, было изменено, чтобы включить выражения для индукции JNK и подавления ERK5.Чтобы связать это дополнение с базовой моделью, мы предполагаем, что MKK (MAPKK) следует тому же профилю активации, что и CAC. Это разумно, учитывая, что САС активирует PKC, которая является вышестоящим активатором различных каскадов MAPK в гонадотропных клетках [15]. Тем не менее, поскольку [CAC] находится в диапазоне от 0,1 до 1 мкМ, мы умножаем его на коэффициент 50 и повторно назначаем его единицу как нМ, чтобы преобразовать [CAC] в [MKK] базовой модели. В качестве альтернативы, мы можем совместно умножить [CAC] на 50 нМ и 1 мкМ ^-1, чтобы произвести такое же преобразование, но без необходимости повторного назначения единиц.

Обычные и запаздывающие дифференциальные уравнения математической модели были преобразованы в код Matlab и запущены на ноутбуке Pentium M с использованием Matlab 7.0.4 с решателем ode23 или ode23s. В конце каждого прогона моделирования производился ряд ключевых считываний. Во-первых, в качестве меры экспрессии гена субъединицы гонадотропина принимали концентрацию каждой субъединицы в конечный момент времени. Поскольку для них не проводилась деградация, это количество представляет собой накопленное количество продуцируемой субъединицы мРНК.Во-вторых, для базовой и расширенной моделей была отмечена максимальная амплитуда установившегося состояния каждого pMAPK. Это позволяет нам наблюдать влияние различных фосфатаз на активацию каждой MAPK. Однако это было невозможно для полной модели, потому что общее количество GnRH-R всегда меняется, так что уровни активированного MAPK никогда не достигают устойчивого состояния. В-третьих, мы вычислили среднеквадратичное значение каждого активированного MAPK. Поскольку все активированные MAPK колеблются в зависимости от частоты стимула, среднеквадратичное значение обеспечивает хорошую оценку средней активации каждой MAPK.Кроме того, расчет среднеквадратичного значения как для свободных, так и для связанных с лигандом рецепторов дает разумное приближение к средней концентрации рецепторов. Среднеквадратичное значение для любого количества определяется по формуле:

Наконец, общее количество MAPK, активированных на протяжении всего моделирования, дается площадью под кривой решения для каждого из pMAPK. Поскольку нет явного аналитического решения для уравнений модели, мы вычисляем его, используя функцию «trapz» в Matlab, которая использует правило трапеций для вычисления требуемой квадратуры.

скриптов Matlab, используемых для моделирования и анализа результатов, будут доступны по запросу.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Анализ чувствительности базовой модели. Базовая модель моделировалась в течение 1440 минут с пятью различными частотами экспоненциального импульсного профиля MAPKK: 8 минут, 30 минут, 60 минут, 120 минут и 240 минут. После этого каждую кинетическую константу, в свою очередь, изменяли на 10%, чтобы визуализировать влияние таких колебаний на общую способность системы к частотному декодированию.Затем были нанесены кратные различия накопленных концентраций для каждой субъединицы гена. Здесь показаны только результаты для кинетической константы kcat1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.s005

(0,16 МБ PDF)

Рисунок S2.

Анализ чувствительности расширенной модели без рецепторной динамики. Расширенная модель без динамики рецепторов, но с включением ERK5, моделировалась в течение 1440 мин с пятью различными частотами экспоненциального импульсного профиля MAPKK: 8 мин, 30 мин, 60 мин, 120 мин и 240 мин.После этого каждая кинетическая константа, относящаяся к ERK5, изменялась на 10%, в свою очередь, чтобы визуализировать влияние таких колебаний на общую способность системы к частотному декодированию. Затем были нанесены кратные различия накопленных концентраций для каждой субъединицы-гена. Здесь показаны только результаты для кинетической константы kcat1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.s006

(0,16 МБ PDF)

Рисунок S3.

Анализ чувствительности расширенной модели с динамикой рецептора к k1.Расширенная модель с динамикой рецепторов моделировалась в течение 1440 мин. После этого k1 изменяли на 10%, чтобы визуализировать влияние таких колебаний на общую способность системы к частотному декодированию. Затем были нанесены кратные различия накопленных концентраций для каждой субъединицы гена.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.s007

(0,16 МБ PDF)

Рисунок S4.

Анализ чувствительности расширенной модели с динамикой рецептора к k11. Расширенная модель с динамикой рецепторов моделировалась в течение 1440 мин.После этого k11 изменяли на 10%, чтобы визуализировать влияние таких колебаний на общую способность системы к частотному декодированию. Затем были нанесены кратные различия накопленных концентраций для каждой субъединицы-гена.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.s008

(0,16 МБ PDF)

Рисунок S5.

Анализ чувствительности расширенной модели с динамикой рецептора к кинетическим константам, отличным от k1 и k11. Расширенная модель с динамикой рецепторов моделировалась в течение 1440 мин.После этого каждую кинетическую константу, кроме k1, k11 и уже протестированных, изменяли на 10%, в свою очередь, чтобы визуализировать влияние таких колебаний на общую способность системы к частотному декодированию. Затем были нанесены кратные различия накопленных концентраций для каждой субъединицы-гена. Здесь показаны только результаты для кинетической постоянной k3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007244.s009

(0,16 МБ PDF)

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SL ZN GR PM.Проведены эксперименты: SL LP JHT. Проанализированы данные: SL LP PM. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SL ZN PM. Написал статью: SL PM.

Список литературы

1. Папавасилиу С.С., Змейли С., Хури С., Ландефельд Т.Д., Чин В.В. и др. (1986) Гонадотропин-рилизинг-гормон по-разному регулирует экспрессию генов альфа- и бета-субъединиц лютеинизирующего гормона у самцов крыс. Proc Natl Acad Sci USA 83: 4026–4029.
2. Dalkin AC, Haisenleder DJ, Ortolano GA, Ellis TR, Marshall JC (1989) Частота стимуляции гонадотропин-высвобождающего гормона по-разному регулирует экспрессию рибонуклеиновой кислоты-мессенджера субъединицы гонадотропина.Эндокринология 125: 917–924.
3. Haisenleder DJ, Ortolano GA, Dalkin AC, Ellis TR, Paul SJ, et al. (1990) Дифференциальная регуляция экспрессии гена субъединицы гонадотропина амплитудой пульса гонадотропин-рилизинг-гормона у самок крыс. Эндокринология 127: 2869–2875.
4. Haisenleder DJ, Dalkin AC, Ortolano GA, Marshall JC, Shupnik MA (1991) Пульсирующий стимул, высвобождающий гонадотропин, необходим для увеличения транскрипции генов субъединиц гонадотропина: доказательства дифференциальной регуляции транскрипции с помощью частоты пульса in vivo .Эндокринология 128: 509–517.
5. Ferris HA, Шупник М.А. (2006) Механизмы пульсирующей регуляции генов субъединиц гонадотропина с помощью GnRh2. Биол Репрод 74: 993–998.
6. Дэвидсон Дж. С., Уэйкфилд И. К., Миллар Р. П. (1994) Отсутствие быстрой десенсибилизации рецептора гонадотропин-рилизинг-гормона мыши. Biochem J 300: 299–302.
7. Sealfon SC, Weinstein H, Millar RP (1997) Молекулярные механизмы взаимодействия лиганда с рецептором гонадотропин-рилизинг-гормона.Endocr Rev 18: 180–205.
8. Ruf F, Fink MY, Sealfon SC (2003) Структура сигнальной сети, стимулированной рецептором GnRH: выводы из геномики. Фронт нейроэндокринол 24: 181–199.
9. Pawson AJ, Faccenda E, Maudsley S, Lu ZL, Naor Z и др. (2008) Рецепторы гонадотропин-рилизинг-гормона I типа млекопитающих подвергаются медленной, конститутивной, независимой от агонистов интернализации. Эндокринология 149: 1415–1422.
10. Катт Дж., Дункан Дж., Хербон Л., Баркан А., Маршалл Дж. (1985) Частота стимуляции гонадотропин-рилизинг-гормона определяет количество рецепторов гонадотропин-рилизинг-гормона гипофиза.Эндокринология 116: 2113–2115.
11. Kaiser UB, Jakubowiak A, Steinberger A, Chin WW (1997) Дифференциальные эффекты частоты пульса гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) на субъединицу гонадотропина и уровни рибонуклеиновой кислоты-мессенджера рецептора GnRH in vitro. Эндокринология 138: 1224–1231.
12. Kaiser UB, Sabbagh E, Katzenellenbogen RA, Conn PM, Chin WW (1995) Механизм дифференциальной регуляции экспрессии гена субъединицы гонадотропина с помощью гонадотропин-рилизинг-гормона.Proc Natl Acad Sci USA 92: 12280–12284.
13. Bedécarrats GY, Kaiser UB (2003) Дифференциальная регуляция активности промотора гена субъединицы гондадотропина с помощью пульсирующего гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) в перифузированных клетках LβT2: роль концентрации рецептора GnRH. Эндокринология 144: 1802–1811.
14. Эллсуорт Б.С., Уайт Б.Р., Бернс А.Т., Черрингтон Б.Д., Отис А.М. и др. (2003) активация c-Jun N-концевой киназой активаторного протеина-1 лежит в основе гомологичной регуляции гена рецептора гонадотропин-рилизинг-гормона в клетках aT3-1.Эндокринология 144: 839–849.
15. Naor Z, Bernard O, Seger R (2000) Активация каскадов MAPK рецепторами, связанными с G-белком: случай рецептора гонадотропин-рилизинг-гормона. Тенденции метаболизма эндокринола 11: 91–99.
16. Харрис Д., Бонфил Д., Чудерленд Д., Краус С., Сегер Р. и др. (2002) Активация каскадов MAPK с помощью GnRH: ERK и Jun N-терминальная киназа вовлечены в базальную и GnRH-стимулированную активность промотора субъединицы LHβ гликопротеинового гормона.Эндокринология 143: 1018–1025.
17. Харрис Д., Чудерленд Д., Бонфил Д., Краус С., Сегер Р. и др. (2003) Киназа и c-src, регулируемые внеклеточными сигналами, но не N-терминальная киназа Jun, вовлечены в базальную активность промотора α-субъединицы гликопротеинового гормона, стимулированную гонадотропин-рилизинг-гормоном. Эндокринология 144: 612–622.
18. Бонфил Д., Чудерланд Д., Краус С., Шахбазиан Д., Фридберг И. и др. (2004) Киназа, регулируемая внеклеточными сигналами, Jun N-терминальная киназа, p38 и c-src участвуют в стимулируемой гонадотропин-высвобождающим гормоном активности промотора β-субъединицы фолликулостимулирующего гормона гликопротеинового гормона.Эндокринология 145: 2228–2244.
19. Kasler HG, Victoria J, Duramad O, Winoto A (2000) ERK5 — это новый тип митоген-активируемой протеинкиназы, содержащей домен активации транскрипции. Mol Cell Biol 20: 8382–8389.
20. Лим С., Луо М., Кох М., Ян М., Бин Абдул Кадир М.Н. и др. (2007) Определенные механизмы, включающие различные гистоновые деацетилазы, подавляют экспрессию двух генов β-субъединиц гонадотропина у незрелых гонадотропов, и их действие преодолевается гонадотропин-рилизинг-гормоном.Mol Cell Biol 27: 4105–4120.
21. Sadie H, Styger G, Hapgood J (2003) Экспрессия гена рецептора гонадотропин-рилизинг-гормона мыши в клетках гонадотропа αT3-1 стимулируется циклическим 3 ‘, 5’-аденозинмонофосфатом и протеинкиназой A и модулируется стероидогенным фактором — 1 и Нур 77. Эндокринология 144: 1958–1971.
22. Zhang T, Roberson MS (2006) Роль фосфатаз киназы MAP в GnRH-зависимой активации киназ MAP. J Mol Endocrinol 36: 41–50.
23. Джеффри К.Л., Кэмпс М., Роммель С., Маккей С.Р. (2007) Ориентация на фосфатазы с двойной специфичностью: манипулирование передачей сигналов киназы MAP и иммунными ответами. Nat Rev Drug Discov 6: 392–403.
24. Wurmbach E, Yuen T, Ebersole BJ, Sealfon SC (2001) Организация генной сети, связанной с рецептором гонадотропин-рилизинг-гормона. J Biol Chem 276: 47195–47201.
25. Kanasaki H, Bedécarrats GY, Kam K-Y, Xu S, Kaiser UB (2005) Зависимая от частоты пульса активация гонадотропин-рилизинг-гормона киназных путей, регулируемых внеклеточными сигналами, в перифузированных клетках LβT2.Эндокринология 146: 5503–5513.
26. Лоусон М.А., Цуцуми Р., Чжан Х., Талукдар И., Батлер Б.К. и др. (2007) Пульсовая чувствительность промотора бета лютеинизирующего гормона определяется петлей отрицательной обратной связи, включающей ранний ростовой ответ-1 и связывающий белок Ngfi-A 1 и 2. Mol Endocrinol 21: 1175–1191.
27. Krakauer DC, Page KM, Sealfon SC (2002) Динамика модуля сети передачи сигналов GnRH. Дж. Теор Биол 218: 457–470.
28.Ruf F, Sealfon SC (2004) Геномический взгляд на сигнальные цепи гонадотропов. Тенденции метаболизма эндокринола 15: 331–338.
29. Грумбах М.М., Стайн Д.М. (2003) Половое созревание: онтогенез, нейроэндокринология, физиология и расстройства. В: Ларсен П.Р., Кроненберг Х.М., Мелмед С., Полонский К.С., редакторы. Учебник эндокринологии Уильямса 10 ^th edition: Saunders Elsevier. С. 1115–1286.
30. Buchler NE, Gerland U, Hwa T (2003) О схемах транскрипционной логики.Proc Natl Acad Sci USA 100: 5136–5141.
31. Green JBA, New HV, Smith JC (1992). Ответы эмбриональных клеток Xenopus на активин и Fgf разделены пороговыми значениями нескольких доз и соответствуют различным осям мезодермы. Ячейка 71: 731–739.
32. Gurdon JB, Bourillot PY (2001) Интерпретация градиента морфогенов. Природа 413: 797–803.
33. Hazzalin CA, Mahadevan LC (2002) MAPK-регулируемая транскрипция: непрерывно изменяющийся генный переключатель? Nat Rev Mol Cell Biol 3: 30–40.
34. Goldbeter A, Gonze D, Pourquie O (2007) Острые пороги развития, определяемые через бистабильность антагонистическими градиентами ретиноевой кислоты и передачи сигналов FGF. Dev Dynamics 236: 1495–1508.
35. Goldbeter A (1991) Минимальная каскадная модель митотического осциллятора, включающая циклин и киназу cdc2. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9107–9111.
36. Owens DM, Keyse SM (2007) Дифференциальная регуляция передачи сигналов киназы MAP с помощью протеинфосфатаз с двойной специфичностью.Онкоген 26: 3203–3213.
37. Goldbeter A, Gonze D, Houart G, Leloup JC, Halloy J и др. (2001) От простого к сложному колебательному поведению в сетях метаболического и генетического контроля. Хаос 11: 247–260.
38. Holtzendorff J, Hung D, Brende P, Reisenauer A, Viollier PH и др. (2004) Осциллирующие глобальные регуляторы контролируют генетический контур, управляющий клеточным циклом бактерий. Science 304: 983–987.
39. Гармендиа-Торрес C, Goldbeter A, Jacquet M (2007) Нуклеоцитоплазматические колебания дрожжевого транскрипционного фактора Msn2: доказательства периодической активации PKA.Curr Biol 17: 1044–1049.
40. Борнхольдт С. (2005) Системная биология. При моделировании больших генетических сетей меньше значит больше. Наука 310: 449–451.
41. Koschorreck M, Conzelmann H, Ebert S, Ederer M, Gilles ED (2007) Сокращенное моделирование передачи сигнала — модульный подход. BMC Bioinformatics 8: 336.
42. Ивахно С., Армстронг Дж. Д. (2008) Нелинейное уменьшение размерности сигнальных сетей. BMC Syst Biol 1: 27.
43.Melamed P, Abdul Kadir MN, Wijeweera A, Seah S (2006) Транскрипция генов β-субъединиц гонадотропина включает перекрестное взаимодействие между факторами транскрипции и ко-регуляторами, которые опосредуют действия регуляторных гормонов. Эндокринол клеток Mol 252: 167–183.
44. Luo M, Koh M, Feng J, Wu Q, Melamed P (2005) Перекрестный разговор в гормонально регулируемой транскрипции генов посредством индукции убиквитилирования рецептора эстрогена. Mol Cell Biol 25: 7386-7398.
45.Bhalla US, Iyengar R (1999) Новые свойства сетей биологических сигнальных путей. Наука 283: 381–387.
46. Washington TM, Blum JJ, Reed MC, Conn PM (2004) Математическая модель высвобождения ЛГ в ответ на непрерывное и пульсирующее воздействие гонадотрофов на гонадолиберин. Теорет Биол и Мед Модель 1: 9.

Прекращение трансляции в Escherichia coli: три основания, следующие за перекрестной сшивкой стоп-кодона, для высвобождения фактора 2 и влияют на эффективность декодирования сигналов, содержащих UGA | Исследование нуклеиновых кислот

Абстрактные

Наблюдения за тем, что фактор высвобождения 2 (RF2) Escherichia coli перекрестно связывается с основанием, следующим за стоп-кодоном (+4 N), и что идентичность этого основания сильно влияет на эффективность декодирования стоп-сигналов, побудили нас определить, действительно ли был более расширенный сигнал завершения для распознавания RF2.Анализ 3′-контекстов 1248 генов в геноме E.coli , заканчивающемся UGA, показал сильное смещение для U в положении +4 и общее смещение для A и против C в большинстве положений до +10, что согласуется с понятие элемента расширенной последовательности. Сайт-направленное перекрестное связывание происходило с RF2 из тио-U, расположенного на +4, +5 и +6 основаниях, следующих за стоп-кодоном UGA, но не дальше (от +7 до +10). Изменение оснований от +4 до +6 модулирует силу поперечной связи от +1 инварианта U к RF2.Сильная систематическая ошибка отбора для конкретных оснований в положениях от +4 до +6 определенных сайтов терминации E.coli UGANNN коррелировала в некоторых случаях с эффективностью перекрестного связывания с RF2 и in vivo силой сигнала терминации . Эти данные предполагают, что RF2 может распознавать по меньшей мере гексануклеотидную UGA-содержащую последовательность и что конкретные комбинации оснований в этой последовательности влияют на эффективность декодирования сигнала терминации.

Введение

Факторы высвобождения полипептидной цепи (RF) класса I представляют собой белки, участвующие в декодировании сигнала терминации трансляции (1).Модель аналога тРНК того, как функционируют RF, была предложена после доказательства того, что эти белки охватывают сайт декодирования малой субъединицы рибосомы и пептидилтрансферазный центр большой субъединицы, такой как тРНК (2). Впоследствии было высказано предположение, что область RF имитирует антикодон тРНК и является гомологичной областям домена IV EF-G (3-5). В то время как распознавание тРНК трансляционных «сигналов элонгации» (смысловых кодонов) включает в себя только три основания в мРНК из-за взаимодействия кодон: антикодон, распознавание сигналов терминации трансляции белками RF явно должно происходить с помощью другого механизма и может включать элемент последовательности больше трех оснований (6,7).Более трех десятилетий всесторонние исследования подавления бессмысленных кодонов подтвердили концепцию, что сигнал терминации может быть> 3 нт (8-21). Выявление элементов, важных для прекращения приема, оказалось трудным, и потребовалась разработка новых подходов для решения этой проблемы.

С этой целью была создана база данных TransTerm, содержащая последовательности на сайтах терминации трансляции (22), которая постоянно развивается и обновляется (23). Мы использовали эту базу данных для анализа последовательностей вокруг стоп-кодонов в генах от широкого круга организмов и показали, что существует значительный перекос в контексте окружающих кодонов по обе стороны от терминирующего кодона (24).Наиболее поразительное смещение было в положении после кодона (+4 основания), и был применен ряд экспериментальных подходов с различными организмами, чтобы предоставить убедительные доказательства того, что основание в этом положении является ключевым фактором, определяющим эффективность, с которой сигнал передается. декодировано (16,25–27). In vitro эксперименты с терминальными комплексами E.coli с использованием сшивающего фрагмента нулевой длины, тио-U, в качестве основания +4 мРНК, показали перекрестное связывание с декодирующим фактором, что подразумевает близость RF к этому положению в мРНК (28).

Статистический анализ сайтов терминации трансляции поднял возможность того, что могут быть дальнейшие контакты между декодирующим RF и другими основаниями в 3′-контексте стоп-кодона, и элемент расширенной последовательности может формировать часть молекулярной сигнатуры терминации. сигнал. В этом исследовании мы рассмотрели этот вопрос, используя терминальные комплексы с E.coli RF2 и небольшие сконструированные мРНК, содержащие остатки тио-U (29) в различных положениях 3 ‘от стоп-кодона.Последующая фотоактивация вызывает перекрестные связи с тио-U и позволяет «сделать снимок» того, где декодирующие RF молекулы «фиксируются» в непосредственной близости от оснований. Кроме того, мы определили in vivo , влияют ли выбранные контексты из анализа TransTerm на силу сигнала завершения, когда они конкурируют с событием сдвига кадра +1 на сайте RF2 сдвига кадра.

Материалы и методы

Материалы

дезоксиолигонуклеотидов получали с использованием ДНК-синтезатора Applied Biosystems 380B или приобретали в Macromolecular Resources, Государственный университет Колорадо.[α- ³² P] GTP (3000 Ки / ммоль) и мембраны для переноса Hybond были поставлены от Amersham. Набор RiboMAX ^™ Large Scale RNA Production System (Promega) использовали для реакций транскрипции in vitro . тРНК ^Ala-2 была предоставлена Subriden. УФ-облучение проводили с использованием 15-ваттного черного света National Matsushita (FL15 BL) в УФ-световом боксе Griffin через стеклянный фильтр, непроницаемый для света <300 нм. Рибонуклеаза Т1 была приобретена у Boehringer Mannheim.Плазмида pMAL ^™ -c2 и антитело к мальтозо-связывающему белку (MBP), рестрикционные ферменты и буферы, а также ДНК-лигаза Т4 были приобретены в New England Biolabs. Для получения плазмидной ДНК использовали набор для очистки ДНК Promega Wizard ^™ Miniprep, и клонированную ДНК секвенировали с использованием секвенатора 373A AB1. Плазмиды электропорировали в бактериальные клетки с использованием манипулятора Electro Cell Manipulator © 600 (BTX). Schleicher и Schuell поставили мембраны для переноса нитроцеллюлозы. Остальные химические реактивы были закуплены у Sigma.Компания Bio-Rad поставила ячейку для электрофореза Mini-PROTEAN II и ячейку для электрофоретического переноса Mini Trans-Blot, которые использовались для гель-электрофореза и переноса белка соответственно, а также денситометр для визуализации GS-670, используемый для лазерной денситометрии белков из in vivo бактериальных экспериментов. Для анализа полос, полученных в результате авторадиографии сшитых белков, использовали лазерный денситометр LKB ULTROSCAN XL.

Среды и штаммы бактерий

Бактерии, содержащие плазмиды, придающие устойчивость к ампициллину, выращивали в бульоне Лурия со 100 мкг / мл ампициллина.Экспрессию белка индуцировали промотором P ^tac с помощью IPTG в концентрации 1 мМ. Первичное клонирование было выполнено в штамме E.coli TG1, затем экстрагированные плазмиды были электропорированы в штамм E.coli FJU112 [D (lac pro) gyrA ara recA56∧Tn / 10 , F4lacI ^Q1] (30) для анализа гибридных белков. Этот штамм содержит рибосомы дикого типа и не содержит супрессорных тРНК, которые могли бы конкурировать с событиями терминации или сдвига рамки считывания в анализе терминации трансляции / сдвига рамки считывания.

Компьютерный анализ последовательности

Статистический анализ нуклеотидных последовательностей был проведен на полном геноме E.coli (номер доступа в GenBank U00096) после внесения в базу данных TransTerm (23; http://biochem.otago.ac.nz:800/Transterm/ homepage.html), как описано ранее (31).

Для сигналов завершения UGA были вычислены значения неслучайности в каждом положении нуклеотида, следующем за стоп-кодоном. Ожидаемые значения были предсказаны частотами мононуклеотидов, наблюдаемыми в 100 нуклеотидах некодирующей области 3 ‘стоп-кодона UGA (рис.1А). Если основание появлялось в месте терминации с большей частотой, чем ожидалось, то смещение было представлено как положительное значение. Если это происходило с более низкой частотой, то смещение представлялось как отрицательное значение. В таком анализе каждое значение χ ² умножалось на знак z, где (наблюдаемое — ожидаемое) = z (рис. 1B).

Отклонение в использовании сигналов терминации гексануклеотида (фиг. 4A) рассчитывали следующим образом: отклонение = (наблюдаемое — ожидаемое) / ожидаемое. Для данного стоп-сигнала гексануклеотида ожидаемые значения рассчитывали на основании появления гексануклеотидного сигнала в некодирующей области всех генов.Например, сигнал UGACUG возник 72 раза во всех некодирующих областях. Поскольку в некодирующих регионах было всего 12179 «стоп-сигналов», доля UGACUG составила 0,14%. Следовательно, в сайтах терминации из 4160 гексануклеотидных стоп-сигналов, включенных в этот анализ, ожидается, что 0,14% или 25 будут UGACUG. Это контрастирует с наблюдаемым появлением 6. Существует общее предубеждение против сигналов терминации UGAC и UGAA в геноме E.coli . Поэтому при определении отклонения для стоп-сигналов UGACUN и UGAAGN рассчитывалась разница между фактическим отклонением для каждого отдельного сигнала в наборе и средним отклонением всех сигналов в каждом наборе (рис.5А).

Рисунок 1

Статистический анализ 3′-контекста UGA-содержащих сигналов терминации E.coli . ( A ) Неслучайность (χ ²) определяли для каждого из 17 положений от 3 ‘до 1248 генов, оканчивающихся на UGA, из полного генома E.coli . ( B ) Смещение каждого основания в положениях от +4 до +10 после стоп-кодонов UGA. Событие с более высокой частотой, чем ожидалось, выражается как положительное значение, а появление с более низкой частотой, чем ожидалось, выражается как отрицательное значение.

Рисунок 1

In vitro транскрипций

Метод Stade et al. (32) использовали для получения 4-тио-UTP из 4-тио-UDP (Sigma). Транскрипционные реакции проводили, как описано (28). Вкратце, одноцепочечные ДНК-матрицы (~ 0,2 нмоль) отжигали до эквимолярного количества праймера полимеразы Т7 в буфере для транскрипции путем нагревания (65 ° C в течение 3 мин), а затем охлаждения до комнатной температуры. Реакции транскрипции (100 мкл об.), Содержащие отожженный праймер: матрицы в буфере для транскрипции с добавлением 7.5 мМ АТФ и ЦТФ, 0,25 мМ GTP, 0,52 мМ 4-тио-UTP, 26 мкКи [α- ³² P] GTP и 3000 ед. Т7 РНК-полимеразы инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Транскрипты мРНК очищали на геле 15% полиакриламид [38: 2 акриламид: бис (акриламид)] / 7 М мочевина / 0,1% SDS, затем локализовали с помощью авторадиографии. Полосы вырезали, экстрагировали буфером фенол / SDS, собирали осаждением этанолом и рассчитывали выходы образцов по излучению Черенкова.

Образование рибосомных комплексов и сайт-направленное сшивание

Рибосомные комплексы были сформированы путем инкубации 25 пмоль 70S рибосом с 1000 пмоль мРНК [³² P], 75 пмоль тРНК ^Ala-2 (антикодон VGC) и 140 пмоль RF2 в 50 мкл буфера, содержащего 20 мМ Tris-HCl pH. 7.4, 100 мМ NH ₄ Cl, 20 мМ MgCl ₂ и 6% (об. / Об.) Этанола при 37 ° C в течение 30 мин. Сшивки формировали путем нанесения комплексов на Parafilm, покоящегося на льду, с последующим облучением УФ-излучением с расстояния 10 см в течение 30 мин.

Анализ сшитых комплексов методом разделения геля

Аликвоты (10 мкл) сшитых комплексов обрабатывали 100 ед. Рибонуклеазы Т1 при 37 ° C в течение 30 мин. Сшитые образцы и образцы, обработанные рибонуклеазой, разделяли на 12% -ной полиакриламидной [29: 1 акриламид: бис (акриламид)] мини-гелевой системе перед переносом на нитроцеллюлозную мембрану, как описано (25).Сшитые белки визуализировали авторадиографией, а интенсивность полос сшивания из по меньшей мере трех отдельных экспериментов измеряли денситометрией. Среднее значение этих измерений использовали для расчета относительной эффективности сшивания специфичных полос RF2-мРНК в различных контекстах.

Конструирование плазмиды и анализ экспрессированных слитых белков

Образование и анализ плазмидных конструкций подробно описано ранее (31).Вкратце, для текущего исследования дополнительные избыточные дезоксиолигонуклеотиды, охватывающие окно сдвига рамки RF2 и содержащие контекстные серии стоп-сигналов UGANUA, UGAAGN и UGACUN, были отожжены и направленно клонированы в экспрессионную плазмиду pMal ™. После введения плазмид в штамм E.coli TG1 рекомбинантные клоны идентифицировали секвенированием. Плазмидная ДНК, экспрессирующая слитые белки из окна сдвига рамки RF2, вводилась в штамм E.coli FJU112, затем индуцировалась экспрессия слитого белка, и продукты анализировались иммунологически после PAGE и вестерн-блоттинга с использованием MBP, как описано (25).Относительные пропорции продуктов сдвига и обрыва были определены методом лазерной денситометрии. Данные по крайней мере трех отдельных экспериментов, в которых использовалось несколько клонов одной и той же конструкции, были использованы для расчета относительной эффективности терминации. Коэффициенты отбора факторов высвобождения рассчитывались с использованием модификации уравнения, выведенного Pedersen и Curran (16), как описано в Poole et al. (25).

Результаты

Анализ оснований от 3 ‘до стоп-кодонов UGA

Недавно последовательность полного E.стал доступен геном coli , что позволяет извлекать контексты всех генов для ввода в нашу базу данных TransTerm (23). Особый интерес для нашей текущей исследовательской программы представляют контексты, расположенные ниже стоп-кодонов UGA (1248 генов из 4268 кодирующих последовательностей полного генома E.coli ). UGA-содержащие сигналы декодируются только с помощью RF2, фактора, используемого для всестороннего исследования сайт-направленного перекрестного связывания с определенных сайтов в мРНК, как описано ниже. Анализ последовательностей в базе данных TransTerm позволил предсказать, как 3′-контексты из стоп-кодонов могут повлиять на завершение трансляции, а затем эти прогнозы были проверены экспериментально.

Неслучайность нуклеотидов в положениях от +4 до +20 после стоп-кодонов UGA показана на рисунке 1A. В соответствии с предыдущими анализами для всех стоп-кодонов в более ограниченном наборе данных (24), наиболее значимое отклонение было для основания, следующего сразу за стоп-кодоном. Однако были смещения (как показано на основании значений χ ²), которые были значительно выше в позициях до +10, которые не были очевидны в более удаленных позициях.

Были ли эти смещения показателем предпочтения определенного основания в каждой позиции (как можно было бы ожидать, если бы был элемент расширенной последовательности, распознаваемый RF2)? Чтобы определить это, встречаемость конкретного основания в каждом положении после UGA на сайтах терминации сравнивали с его появлением после UGA в некодирующих областях.В анализе учитывались первые 100 позиций ниже стоп-кодона каждого гена или меньше позиций, если второй ген начинался в этой области. Из 4268 генов 4160 были включены в анализ, поскольку они не содержали неоднозначности оснований и имели достаточную межгенную последовательность. Если основание происходило в месте терминации с большей частотой, чем ожидалось, то смещение представлялось как положительное значение, если оно происходило с более низкой частотой, то смещение представлялось как отрицательное значение (рис.1Б). Наиболее разительными различиями между сайтами терминации и некодирующими сайтами было сильное смещение для U и против C в положении +4. Для других позиций, расширяющихся до +10, было общее смещение для A в позициях от +6 до +10 и более умеренное смещение по отношению к C.

Мы разделили набор данных на четыре базовых сигнала (UGAN) и проанализировали следующие базы таким же образом. Общая предвзятость в пользу A и против C все еще была очевидна, хотя были некоторые различия среди +4 базовых контекстов (не показаны).Этот анализ показал, почему A, по-видимому, не был значимым в положении +5 (как показано на рис. 1B). Для двух контекстов (+4 A или C) предпочтение было отдано A. Однако это контрастирует с тем, что A относительно редко встречается в двух других контекстах (+4 U или G).

Критический вопрос заключается в том, важны ли эти наблюдаемые статистические смещения для механизма декодирования во время завершения трансляции? Мы уже знаем, что сильное смещение нуклеотидов в положении +4 всех стоп-сигналов глубоко отражает эффективность терминации как у бактерий, так и у млекопитающих (16,25,26), и что это основание находится в непосредственной близости от декодирующего RF (28).В текущем исследовании, чтобы определить степень распознавания RF-сигнатуры, мы использовали стратегию сайт-направленного перекрестного связывания для определения RF-контакта между положениями от +4 до +10 вместе с анализом in vivo , который позволяет проводить измерения мощности сигнала завершения.

RF2 перекрестно связывается с основаниями 3 ‘стоп-кодона UGA

Для анализа степени близости RF2 с основаниями 3 ‘к стоп-сигналу семь ³² P-меченных аналогов мРНК были транскрибированы in vitro из сконструированных длинных олигонуклеотидных матриц.Олигонуклеотиды были сконструированы так, чтобы отражать статистическую погрешность для A в положениях 3′-контекста. Каждый аналог мРНК содержал сшивающий реагент нулевой длины тио-U в положении +1 стоп-сигнала и второй тио-U, расположенный в одном из положений от +5 до +10, заменяющий A. Статистический анализ показал, что U происходит с ожидаемой частотой в большинстве позиций от +5 до +10 после UGAG, сигнала, используемого для этих экспериментов. В качестве положительного контроля мы использовали тио-U для замены G в положении +4, положение, показанное недавно, для поддержки перекрестного связывания с RF2 (28).Ранее было продемонстрировано, что тио-U для замены U в существенном +1 положении стоп-кодона в аналогах мРНК не влияет на связывание RF в терминирующих комплексах (29). В текущих экспериментах терминальные комплексы были сформированы с использованием рибосом E.coli , при этом стоп-кодон мРНК расположен в A-сайте с помощью связанной с P-сайтом тРНК ^Ala-2 в присутствии RF2. Облучение УФ с длинами волн> 300 нм специфически активирует остатки тио-U с образованием поперечных связей с молекулами в непосредственной близости.

Наше предыдущее исследование показало, что RF2, сшитый с любым фрагментом мРНК, задерживается во время электрофореза (28). Подвергая мРНК в сшитом комплексе перевариванию рибонуклеазой Т1, которая специфически разрезает 3′-сторону нуклеотидов G, фрагмент определенной длины присоединяется к RF. Подвижность фрагмента RF2-мРНК затем зависит от длины присоединенного фрагмента мРНК (и, следовательно, положения в мРНК, откуда возникла перекрестная связь). Стратегия с потенциально сшитыми фрагментами мРНК для шести исследуемых мРНК и контроля проиллюстрирована на рисунке 2; диагональные полосы представляют позиции спайности.Сшивка из положения +1 приведет к присоединению динуклеотидного фрагмента к RF2, перекрестная сшивка из положения +4 приведет к присоединению фрагмента декануклеотида, а перекрестная сшивка из любого положения от +5 до +10 оставляет присоединенным октануклеотидный фрагмент. к RF2. На мРНК была введена радиоактивная метка в нуклеотидах G, так что после расщепления рибонуклеазой Т1 и разделения с помощью PAGE сшитые фрагменты можно было идентифицировать с помощью авторадиографии. Мы использовали антитело к RF2, чтобы подтвердить, что фрагмент мРНК был присоединен к фактору.

Рисунок 2

Продукты, полученные в результате расщепления рибонуклеазой (РНКазой) T1 аналогов мРНК, содержащих тио-U. Контрольная мРНК (+1 и +4 тио-U) полностью показана над тестовыми мРНК, содержащими от +1 и +5 до +10 (как показано) тио-U. Сайты расщепления РНКазой Т1 показаны диагональной полосой. Звездочки обозначают радиоактивно меченый G. Сплошные столбцы представляют поперечные связи с RF2 от контрольной мРНК.

Рисунок 2

Продукты, полученные в результате расщепления рибонуклеазой (РНКазой) T1 аналогов мРНК, содержащих тио-U.Контрольная мРНК (+1 и +4 тио-U) полностью показана над тестовыми мРНК, содержащими от +1 и +5 до +10 (как показано) тио-U. Сайты расщепления РНКазой Т1 показаны диагональной полосой. Звездочки обозначают радиоактивно меченый G. Сплошные столбцы представляют поперечные связи с RF2 от контрольной мРНК.

Рисунок 3

Разделение сшитых комплексов в ПААГ. ( A ) Анализ фрагментов мРНК, содержащих UGAU. Дорожки 1 и 2 и дорожки 3 и 4 показывают поперечные связи, образованные в присутствии и в отсутствие RF2, соответственно, как до (дорожки 1 и 3), так и после (дорожки 2 и 4) расщепления Т1 рибонуклеазой (РНКазой).Большая стрелка показывает положение сшитых RF2-мРНК видов до переваривания. Верхние сшитые виды (обозначены звездочкой) на дорожках 1 и 3 представляют собой вероятные сшивки от мРНК к рибосомному белку S1. ( B ) Анализ фрагментов мРНК, содержащих тио-U в положении +1 и второй тио-U в любом из положений от +4 до +10, как показано. Все сшивки образовывались в присутствии RF2. Непереваренный сшитый комплекс показан на дорожке 1 (большая стрелка), а комплексы, показанные на дорожках 2-8, все были расщеплены РНКазой Т1.Верхний сшитый вид (обозначен звездочкой) представляет собой вероятные сшивки от мРНК к рибосомному белку S1.

Рисунок 3

Разделение сшитых комплексов в ПААГ. ( A ) Анализ фрагментов мРНК, содержащих UGAU. Дорожки 1 и 2 и дорожки 3 и 4 показывают поперечные связи, образованные в присутствии и в отсутствие RF2, соответственно, как до (дорожки 1 и 3), так и после (дорожки 2 и 4) расщепления Т1 рибонуклеазой (РНКазой). Большая стрелка показывает положение сшитых RF2-мРНК видов до переваривания.Верхние сшитые виды (обозначены звездочкой) на дорожках 1 и 3 представляют собой вероятные сшивки от мРНК к рибосомному белку S1. ( B ) Анализ фрагментов мРНК, содержащих тио-U в положении +1 и второй тио-U в любом из положений от +4 до +10, как показано. Все сшивки образовывались в присутствии RF2. Непереваренный сшитый комплекс показан на дорожке 1 (большая стрелка), а комплексы, показанные на дорожках 2-8, все были расщеплены РНКазой Т1. Верхний сшитый вид (обозначен звездочкой) представляет собой вероятные сшивки от мРНК к рибосомному белку S1.

Результаты, полученные в контрольном эксперименте (где аналог мРНК содержит тио-U в положениях +1 и +4), показаны на рисунке 3А. Выраженная сшитая полоса наблюдалась в комплексах, содержащих RF2 (дорожка 1, стрелка), которая отсутствовала в комплексах, лишенных RF2 (дорожка 3). Расщепление рибонуклеазой Т1 разрушило комплекс и образовало две полосы. Ранее мы идентифицировали нижнюю заметную полосу в положении нативного RF2 (46 кДа) (дорожка 2) как происходящую от поперечной сшивки в положении +1 и содержащую динуклеотид, сшитый с RF2.Менее интенсивная RF-специфическая радиоактивно меченая полоса на дорожке 2, которая мигрировала между полосой в положении нативного RF2 (полоса +1) и положением непереваренного комплекса RF2-мРНК, получена из поперечной сшивки в положении +4 и содержит сшитый декануклеотидный фрагмент. к РФ2 (28). Эта полоса отсутствовала, когда мРНК содержала только тио-U в положении +1 стоп-кодона (не показано). Мы использовали ранее снятие отпечатков пальцев РНК, чтобы подтвердить, что эти полосы возникли в результате перекрестных связей в положениях +1 и +4 в РНК (28).Две полосы были иммунологически положительными по RF2 и отсутствовали в комплексах, лишенных RF2 (дорожки 3 и 4).

Типичные образцы перекрестных связей RF2-мРНК для аналогов мРНК, содержащих тио-U из положения +4 в положение +10, после расщепления рибонуклеазой T1 показаны на рисунке 3B. Включен непереваренный сшитый комплекс RF2-мРНК (дорожка 1). Все сшитые комплексы показали значительную полосу в положении нативного RF2, соответствующую сшивке из положения +1 (дорожки 2-8). Более высокая RF2-специфическая сшитая полоса, которая происходит из нижнего положения, была очевидна в комплексах, содержащих +5 и +6 тио-U (дорожки 3 и 4), а также +4 (дорожка 2).В каждом случае они реагировали с RF2-специфическим антителом, что согласуется с миграцией RF2, которая задерживается присоединенными октануклеотидными фрагментами. Напротив, эта полоса отсутствовала в комплексах RF2-мРНК с тио-U, расположенным в положениях от +7 до +10 мРНК (дорожки 5-8). Полоса, мигрирующая в положении непереваренного комплекса RF2-мРНК, иногда присутствовала (звездочка, дорожки 2-8), но не реагировала с RF2-специфическим антителом. Было показано, что +1 thio-U-содержащий аналог мРНК перекрестно связывается с рибосомным белком S1 в присутствии или в отсутствие RF и мигрирует в аналогичное положение (29) и, скорее всего, является идентичностью этой радиоактивно меченной полосы.

Рисунок 4

Анализ контекстов гексануклеотидов UGANUA. ( A ) Отклонения наблюдаемых случаев от ожидаемых для каждого основания N в данном контексте. Полосы над линией означают, что основание встречается чаще, чем ожидалось, а столбцы ниже линии означают, что основание встречается реже, чем ожидалось. ( B ) Эффективность терминации трансляции in vivo в контекстах UGA N UA. Данные были получены с помощью лазерной денситометрии экспрессированных белковых продуктов, как описано в разделе «Материалы и методы».( C ) Анализ фрагментов мРНК, содержащих стоп-сигналы UGA N UA (N U). Все сшивки образовывались в присутствии RF2. Левая полоса показывает сшитый комплекс RF2-мРНК до расщепления РНКазой Т1. Верхние сшитые виды на всех дорожках (звездочка) представляют собой вероятные сшивки от мРНК к рибосомному белку S1. ( D ) Относительная эффективность перекрестной связи +1 в мРНК, содержащих контексты UGA N UA (N U). Полосы по меньшей мере из трех отдельных экспериментов анализировали с помощью лазерной денситометрии, и эффективность сшивок +1 выражалась в процентах от общих объединенных сшивок положений +1 и +5.

Рисунок 4

Контекст сигнала остановки влияет на эффективность завершения

Эксперименты по сшиванию показали, что RF находится в непосредственной близости от +1 и +4 — +6 положений мРНК. Эффективность завершения может быть связана с тем, насколько хорошо РЧ контактирует с каждым сигналом в этих положениях. UGACUA и UGAGUA являются примерами гексануклеотидных контекстов, которые, как мы показали ранее, имеют низкую и высокую эффективность стоп-сигнала соответственно (25). Поскольку близость мРНК к RF2 простирается до основания +6, мы исследовали, будут ли вариации оснований +4, +5 и +6 в этих двух контекстах влиять на перекрестную связь от инвариантной позиции +1 U UGA.

Во-первых, изменение порядка оснований +5 и +6 с UGAGUA на UGAGAU увеличило эффективность сшивания RF2 из положения +1 на 37%, но изменение с UGACUA на UGACAU немного снизило эффективность (Таблица 1). Эти результаты предполагают, что 3′-контекст может модулировать близость или ориентацию первой позиции стоп-кодона по отношению к RF-2. Во-вторых, подробное сравнение характеристик UGACUA, слабого сигнала, с UGAGUA и двумя другими членами серии, UGAUUA и UGAAUA, было исследовано по ряду критериев.На Фигуре 4А показан статистический анализ относительной частоты этих сигналов в сайтах терминации по сравнению с ожидаемой после сравнения с некодирующими областями. В позиции +4 контекста UGANUA выбирается G, U находится на ожидаемой частоте, а A и особенно C выбираются против. На рис. 4В показано влияние основания +4 на эффективность терминации in vivo на эти сигналы UGANUA в E.coli (31), как измерено в конкурентном анализе, где терминация конкурирует с событием сдвига рамки считывания на сайте перекодирования RF2.Порядок эффективности сигнала был U> G> A> C для основания +4 в этих гексануклеотидах. Скорость отбора RF (16) для UGAUUA была в 28 раз эффективнее, чем для UGACUA. Отражается ли этот порядок силы сигнала в контекстах UGANUA в том, насколько эффективно RF2 может быть сшит с основаниями +1 и +5 thio-U тех же последовательностей? На рис. 4С показан пример схем сшивки для контекстов UGAGUA, UGAAUA и UGACUA после расщепления рибонуклеазой T1. Контекст UGAUUA не был включен, поскольку соседние тио-Us +4 и +5 не могли быть разделены с помощью стратегии расщепления рибонуклеазой T1 и могли бы затруднить анализ.Эффективность сшивания от основания +5 показала небольшую разницу между тремя контекстами. Напротив, контакт RF2 с основанием +1 показал значительные вариации, при этом сила сшивки уменьшалась в порядке +4 G> A> C. Гистограмма относительной эффективности образования сшивки +1, где основание +4 представляет собой G, A или C, показана на Фигуре 4D. Поразительно, что этот порядок эффективности сшивки коррелирует как с частотой появления сигналов в сайтах терминации, так и с эффективностью терминации in vivo , управляемой основанием +4 сигналов (рис.4A и B).

Таблица 1

Относительная эффективность поперечных связей RF2 для каждого гексануклеотидного сигнала

Эффективность — это средняя интенсивность поперечных связей (измеренная с помощью денситометрии) для каждого сигнала относительно таковой для UGAGUA и UGACUA, соответственно. Пятая и шестая базы показаны во главе таблицы.

Таблица 1

Относительная эффективность сшивки RF2 для каждого гексануклеотидного сигнала

Эффективность — это средняя интенсивность сшивки (измеренная денситометрией) для каждого сигнала относительно таковой для UGAGUA и UGACUA, соответственно.Пятая и шестая базы показаны во главе таблицы.

Статистический анализ был выполнен на сайтах терминации из полного генома E.coli с шестью основаниями (от +1 до +6), составляющими сигнал. Пять из шести оснований были фиксированными, а положение оставшейся части было изменено. Ошибки в количестве конкретных последовательностей в каждом наборе данных предоставляют полезные данные для прогнозирования того, какие сигналы завершения могут быть более или менее эффективными. Из этого анализа мы выбрали для исследования несколько гексануклеотидных серий, различающихся по положению +6, включая UGAAGN и UGACUN.Эти последние контексты показывают поразительные статистические различия между наблюдаемыми и ожидаемыми встречами на сайтах терминации для каждого из четырех оснований в положении +6 (фиг. 5A). Оба контекста уже строго выбраны из-за +4 A и +4 C соответственно, которые, как известно, влияют на эффективность завершения для сигналов, содержащих UGA, и данные нормализованы для этого +4 базового смещения в каждом случае. Для контекстов UGAAGN A и особенно C выбираются напротив в позиции +6.Контексты UGACUN редки на сайтах терминации с более сильным смещением против A и G в положении +6, чем против U и C. Выбор против A в этих контекстах контрастировал с общим смещением для A как базы +6, когда все Рассмотрены сигналы завершения, содержащие UGA (рис. 1Б).

Рисунок 5

Анализ контекстов гексануклеотидов UGAAG N и UGACU N . ( A ) Отклонения наблюдаемых случаев от ожидаемых для каждого основания N в этих контекстах.Полосы над линией означают, что основание встречается чаще, чем ожидалось, а столбцы ниже линии означают, что основание встречается реже, чем ожидалось. ( B ) Скорость отбора in vivo RF в каждом контексте. Скорость отбора RF относительно скорости сдвига рамки рассчитывалась на основе данных, полученных по меньшей мере из трех отдельных экспериментов, в которых использовались несколько клонов одной и той же конструкции.

Рисунок 5

Анализ контекстов гексануклеотидов UGAAG N и UGACU N .( A ) Отклонения наблюдаемых случаев от ожидаемых для каждого основания N в этих контекстах. Полосы над линией означают, что основание встречается чаще, чем ожидалось, а столбцы ниже линии означают, что основание встречается реже, чем ожидалось. ( B ) Скорость отбора in vivo RF в каждом контексте. Скорость отбора RF относительно скорости сдвига рамки рассчитывалась на основе данных, полученных по меньшей мере из трех отдельных экспериментов, в которых использовались несколько клонов одной и той же конструкции.

Мы использовали, как указано выше, сайт сдвига рамки в гене RF2 для измерения in vivo скорости RF-отбора по каждому сигналу терминации UGACUN и UGAAGN в конкуренции с событием сдвига рамки в E.coli . Частота выбора RF для контекстов UGAAGN и UGACUN варьировалась с основанием +6 в порядке C = A> G> U для серии UGAAGN и U> G = C >> A для серии UGACUN. В этих случаях, в отличие от серии UGANUA, данные не соответствовали ошибкам статистической выборки.Например, хотя C и G редко обнаруживались в позиции +6 контекстов UGAAGN и UGACUN, соответственно, они не ослабляли сигнал (сравните фиг. 5B с A).

Обсуждение

Статистические погрешности, выходящие далеко за пределы триплета, были обнаружены в основаниях ниже стоп-кодона при исследовании полного генного комплемента E.coli . Если эти контексты последовательностей отражают важный аспект биологии бактериальных клеток, то очевидным кандидатом является фаза завершения биосинтеза белка.

Уже собраны обширные доказательства роли основания, следующего за стоп-кодоном (+4) в терминации полипептидной цепи (16,25–27), и того, что это основание находится в непосредственной близости от декодирующего RF в терминации. комплекс (28). Имеют ли основания за пределами основания +4 роль в завершении и, возможно, являются частью элемента распознавания для декодирующих RF? В данной работе мы объединили два экспериментальных подхода, чтобы ответить на этот вопрос; in vitro, сайт-направленное перекрестное сшивание, и in vivo, — измерение эффективности сдвига рамки считывания как функции конкуренции сигнала терминации.Критический эксперимент, проиллюстрированный на рисунке 3B, показал, что структурные элементы RF2 расположены достаточно близко к основаниям +5 и +6 мРНК для того, чтобы произошло сайт-направленное перекрестное связывание. В предыдущем исследовании с основанием +4 мы показали, что полоса с задержкой PAGE, высвобождаемая из сшитого продукта после расщепления РНКазой T1 (рис. 3A), содержала +4 тио-U олигонуклеотид (28). Мы интерпретируем эти новые данные, чтобы предположить, что контакт «антикодоноподобной» области распознавания RF с мРНК может простираться до основания +6.Невозможность сшивания из положений +7 в +10 может отражать то, что элементы RF-структуры больше не находятся в непосредственной близости от этих оснований, учитывая, что тио-U по существу является сшивающим фрагментом «нулевой длины». Однако также возможно, что микросреда просто может быть неблагоприятной для сшивания по сравнению с положениями от +4 до +6. Мы дополнительно исследовали процесс распознавания, показав, что изменение оснований в положениях +4, +5 и +6 влияет на то, насколько эффективно основание +1 перекрестно связывается с RF.То, что последовательности, расположенные ниже стоп-кодона, могут влиять на это событие, по-видимому, отражает измененную ориентацию мРНК по отношению к критическим элементам структуры RF в положении +1 основания.

База данных TransTerm особенно полезна для прогнозирования последовательностей, которые могут быть сильными или слабыми сигналами завершения, когда длина последовательности мала (например, четыре или даже пять оснований), поскольку в каждом подмножестве встречается относительно большое количество последовательностей. Расширение анализа сигналов завершения в E.coli к гексануклеотидной последовательности находится на пределе достоверности значимости, поскольку количество последовательностей в каждом наборе данных становится относительно небольшим. Это особенно верно, если основание +4 представляет собой C. Тем не менее, мы выбрали потенциально подходящие гексануклеотиды-кандидаты для проверки силы сигнала терминации. Некоторые наборы показали изменение силы сигнала завершения в зависимости от базы +6 (как показано на рис. 5). Эти данные свидетельствуют о том, что основание +6 влияло на прерывание, но не обязательно, как предсказывал анализ TransTerm.

Конечной целью наших продолжающихся исследований было определение элемента согласованной последовательности для сигнала завершения, который распознается RF, но это может быть сложно, особенно если каждая позиция не может быть определена независимо от других. Для серии, различающейся по основанию +4 (серия UGANUA), существует корреляция не только между частотой появления четырех возможных последовательностей на конечных сайтах и их силой при конкуренции со сдвигом кадра на сайте RF2 смещения кадра, но также и с эффективностью сшивки между декодирующим RF и инвариантом +1 U стоп-сигнала (рис.4). В этой серии UGACUA, кажется, является контекстом, который не может быть легко распознан RF2. В самом деле, этот редкий контекст UGA также обнаруживается в сайте перекодирования сдвига рамки +1 самого гена RF2 (33). В этом случае считается, что стоп-сигнал способствует паузе в трансляции, которая, как полагают, усиливает проскальзывание рибосом при прохождении урацилов на мРНК сразу за 5 ‘от стоп-сигнала (34,35).

Важные особенности сигнала завершения могут быть не столь очевидны в общем наборе данных, полученном из всех последовательностей генов организма, тогда как специальная подмножество может быть более информативным.Ранее мы использовали индекс адаптации кодонов (CAI, показатель использования смысловых кодонов, коррелирующий с экспрессией), чтобы показать вполне определенные характеристики в сигнале терминации по отношению к основанию +4 в наиболее выраженной подгруппе (верхние 5–10%). ) (24). Ключевые особенности постепенно становились менее очевидными по мере последовательного изучения подмножеств нижних значений CAI. Например, UAAU, экспериментально показанный как самый сильный сигнал с четырьмя базовыми остановками, на сегодняшний день является наиболее распространенным сигналом в наивысшем подмножестве CAI, тогда как UGAC самый слабый сигнал никогда не встречается в этом подмножестве.Это означает, что гены с высокой экспрессией имеют строгие требования к сильному сигналу, который быстро декодируется, тогда как гены, которые экспрессируются в меньших количествах, могут выдерживать более широкий диапазон сигналов, декодируемых с разной скоростью. Хотя сложно выполнить статистический анализ более крупных элементов последовательностей в подмножестве CAI из ~ 400 генов, поскольку ожидаемые числа для каждой конкретной последовательности малы, в настоящее время мы изучаем, какие гексануклеотидные последовательности встречаются чаще в верхнем подмножестве CAI, чтобы выбрать Последовательности-кандидаты для дальнейшего экспериментального тестирования.

Можно ли будет определить элемент согласованной последовательности для декодирования распознавания RF? Мы определили ядро сигнала завершения как URRN (исключая UGGN и где для E.coli N: U / G> A / C) (28). Важным соображением для согласованной последовательности являются последовательности от 5 ‘до стоп-кодона, и была проведена серия важных экспериментов, которые показали, что по крайней мере два кодона (т.е. шесть оснований от -1 до -6) значительно влияют на эффективность терминации (19 , 20).Здесь кодирующий потенциал 5’-последовательности, скорее всего, является критическим признаком, и эти данные могут отражать взаимодействия, которые декодирующая RF осуществляет с последней тРНК и двумя последними аминокислотами. В настоящее время мы исследуем последовательности 5 ‘и 3’ стоп-кодона вместе. Должна быть возможность определять элементы последовательности, которые распознаются с высокой степенью сродства декодирующим RF и быстро декодируются, а также те, которые распознаются плохо и декодируются медленно. Они будут отмечать крайние значения для согласованного элемента распознавания, и последовательности между этими крайностями, вероятно, будут восприниматься как сигналы терминации большинством генов, которые не подвергаются определенным требованиям экспрессии или не подвергаются событию конкурентного перекодирования.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Марка Дальфина за квалифицированную помощь с базой данных TransTerm. W.P.T. является международным стипендиатом Медицинского института Говарда Хьюза, и описанная здесь работа была поддержана грантом Human Frontier Science Program (присуждена W.P.T. и Йошиказу Накамура) и Фонда Марсдена Новой Зеландии.

Список литературы

1,,,. ,
Gen. Eng.
,
1996
, т.
18
(стр.
157
—
182
)
2,. ,
J. Biol. Chem.
,
1994
, т.
269
(стр.
18899
—
18903
) 3,,,. ,
Proc. Natl. Акад. Sci. США
,
1996
, т.
93
(стр.
5443
—
5448
) 4,,. ,
Ячейка
,
1996
, т.
87
(стр.
147
—
150
) 5,,. ,
Biochimie
,
1996
, vol.
78
(стр.
935
—
943
) 6,. ,
Мол. Microbiol.
,
1996
, т.
21
(стр.
213
—
219
) 7,,,,,. ,
Biochimie
,
1996
, vol.
78
(стр.
945
—
952
) 8. ,
Мол. Genet Genet.
,
1969
, т.
105
(стр.
125
—
130
) 9,,. ,
Колд-Спринг-Харбор Symp. Quant. Биол.
,
1969
, т.
34
(стр.
513
—
520
) 10,,. ,
Мол. Genet Genet.
,
1977
, т.
151
(стр.
137
—
149
) 11,. ,
Природа
,
1980
, т.
286
(стр.
123
—
127
) 12. ,
J. Mol. Биол.
,
1983
, т.
164
(стр.
73
—
87
) 13,. ,
J. Mol. Биол.
,
1983
, т.
164
(стр.
59
—
71
) 14,. ,
Proc. Natl. Акад. Sci. США
,
1989
, т.
86
(стр.
4397
—
4401
) 15,,,,,,. ,
Биохим. Биофиз. Acta
,
1990
, т.
1050
(стр.
259
—
262
) 16,. ,
J. Mol. Биол.
,
1991
, т.
219
(стр.
231
—
241
) 17,,,,. ,
J. Mol. Биол.
,
1992
, т.
225
(стр.
261
—
269
) 18,. ,
J. Mol. Биол.
,
1993
, т.
232
(стр.
1017
—
1029
) 19,,. ,
EMBO J.
,
1994
, т.
13
(стр.
249
—
257
) 20,,. ,
EMBO J.
,
1996
, т.
15
(стр.
1696
—
1704
) 21,,. ,
J. Mol. Биол.
,
1996
, т.
261
(стр.
98
—
107
) 22,,,. ,
Nucleic Acids Res.
,
1993
, т.
21
(стр.
3119
—
3123
) 23,,,. ,
Nucleic Acids Res.
,
1997
, т.
25
(стр.
246
—
247
) 24,,,,,,,,,. ,
Biochem. Cell Biol.
,
1995
, т.
73
(стр.
1095
—
1103
) 25,,. ,
EMBO J.
,
1995
, т.
14
(стр.
151
—
158
) 26,,,,. ,
Proc. Natl. Акад. Sci. США
,
1995
, т.
92
(стр.
5431
—
5435
) 27,,,. ,
J. Mol. Биол.
,
1995
, т.
251
(стр.
334
—
345
) 28,,. ,
РНК
,
1997
, т.
3
(стр.
974
—
982
) 29,,. ,
Nucleic Acids Res.
,
1990
, т.
18
(стр.
6537
—
6544
) 30,. ,
J. Mol. Биол.
,
1990
, т.
215
(стр.
511
—
521
) 31,,,,. ,
Nucleic Acids Res.
,
1996
, т.
24
(стр.
2673
—
2678
) 32,,. ,
Nucleic Acids Res.
,
1989
, т.
17
(стр.
9889
—
9908
) 33,,,. ,
Proc. Natl. Акад. Sci. США
,
1985
, т.
82
(стр.
3616
—
3620
) 34,,,. ,
Колд-Спринг-Харбор Symp. Quant. Биол.
,
1987
, т.
52
(стр.
687
—
693
) 35,. ,
Trends Biochem. Sci.
,
1990
, т.
15
(стр.
186
—
190
)
© 1998 Oxford University Press
Сканер глаза обнаруживает молекулярное старение у людей
(Бостон) — Часто говорят, что глаза — зеркало души.Теперь выясняется, что они также могут быть окнами в старение человека.
Все люди стареют, но отдельные люди делают это с разной скоростью: одни быстрее, другие медленнее. Хотя это наблюдение общеизвестно, общепринятой меры биологического старения не существует. Было предложено и протестировано множество показателей, связанных со старением, но на сегодняшний день не было выявлено ни одного маркера, или не был разработан неинвазивный метод, позволяющий точно измерять и отслеживать биологическое старение людей. В том, что считается первым исследованием такого рода, исследователи из Медицинской школы Бостонского университета (BUSM) обнаружили, что специализированный сканер глаза, который точно измеряет спектроскопические сигналы от белков в хрусталике глаза, может обнаруживать и отслеживать биологическое старение у живых людей. люди.
По мнению исследователей, хронологический возраст не позволяет адекватно измерить индивидуальные вариации в скорости биологического старения. «Отсутствие клинических инструментов и показателей для количественной оценки того, как каждый человек стареет на молекулярном уровне, представляет собой серьезное препятствие для понимания старения и достижения максимального здоровья на протяжении всей жизни», — объясняет автор-корреспондент Ли Э. Голдштейн, доктор медицинских наук, доцент неврологии. , патология и лабораторная медицина, психиатрия и офтальмология в BUSM.
«Хрусталик содержит белки, которые накапливают связанные со старением изменения на протяжении всей жизни. Эти белки хрусталика обеспечивают постоянную запись истории старения каждого человека. Наш сканер глаза может расшифровать эти записи о том, как человек стареет на молекулярном уровне».
Исследователи считают, что эти результаты открывают путь к потенциально трансформирующему клиническому инструменту для объективной оценки и отслеживания молекулярного старения у людей. «Принципы клинического внедрения этой технологии для измерения молекулярного старения аналогичны другим недавно принятым клиническим биомаркерам, включая ПЭТ-визуализацию головного мозга при болезни Альцгеймера, денситометрию костей на предмет остеопороза и анализы сыворотки крови на сахарный диабет», — добавляет Гольдштейн, который также имеет назначение в инженерный колледж Бостонского университета.
Хотя для отслеживания старения человека были разработаны большие батареи тестов, включающие составные метрики, они далеки от лежащих в основе молекулярных механизмов старения и плохо подходят для персонализированной долгосрочной медицинской помощи. «В отличие от этого, технология сканирования глаз, которая исследует белок хрусталика, обеспечивает быстрый, неинвазивный, объективный метод прямого измерения молекулярного старения, который можно легко, быстро и безопасно реализовать на месте оказания медицинской помощи. Такой показатель открывает потенциал для точного медицинского обслуживания на протяжении всей жизни.»
###
В исследовательскую группу вошли исследователи из Инженерного колледжа и Школы общественного здравоохранения Бостонского университета, Бостонской детской больницы, Массачусетской больницы общего профиля, Гарвардской медицинской школы и Вашингтонского университета в Сиэтле.
Результаты опубликованы в Интернете в журнале Journal of Gerontology: Biological Sciences .
Это исследование было поддержано Массачусетским фондом исследования глаз Lions и Фондом офтальмологии детской больницы, Бостон, Массачусетс.
Заявление об отказе от ответственности: AAAS и EurekAlert! не несут ответственности за точность выпусков новостей, размещенных на EurekAlert! участвующими учреждениями или для использования любой информации через систему EurekAlert.
Что означает ISCD? Бесплатный словарь
По словам Фразина, для тысяч детей, получивших помощь от ISCD, занятия спортом в Центре продлевают продолжительность жизни людей с серьезными нарушениями.Согласно недавнему отчету Baltic Exchange и Xinhua, Дубай недавно был включен в пятерку лучших в Индексе развития международного центра судоходства (ISCD), став первым арабским городом, получившим это высшее международное признание в морском секторе. Информационное агентство, дочерняя компания Китайской экономической информационной службы (CEIS), базирующаяся в Лондоне. Официальные позиции Международного общества клинической денситометрии (ISCD) по оценке DXA у детей и подростков. Интерпретация и отчетность по двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии у детей и подростков. подросток: официальные положения ISCD по педиатрии 2007 года.Официальные позиции Международного общества клинической денситометрии и резюме конференции по разработке позиции ISCD 2007 г. (3) Остеопороз был определен как нормальный биохимический уровень сывороточного фосфата кальция и 25-гидроксивитамина D с радиологическими доказательствами остеопороза либо с использованием Международного общества исследований. Критерии клинической денситометрии (ISCD) (установленный (тяжелый) z-показатель остеопороза Bechtold et al., «Здоровье костей у детей и подростков с хроническими заболеваниями, которые могут повлиять на скелет: официальные положения ISCD 2013 г. в педиатрии», Journal of Clinical Densitometry, vol. .Burnham et al., «Оценка двухэнергетической рентгеновской абортиометрии у детей и подростков с заболеваниями, которые могут повлиять на скелет: официальные позиции ISCD 2007 года в педиатрии», Журнал клинической денситометрии, том. Таблица 1 Назначения команд и поведенческие профили членов группы Профиль поведения команды Команда 1 S1 ISCD S5 CSDI S6 Группа DICS 2 S2 SICD S4 CISD S8 CSID S11 Команда SCDI 3 S10 CSDI S13 SICD S15 Команда IDSC 4 S7 CSID S9 CSID S12 Группа ISDC 5 S3 ISCD S14 ISCD Таблица 2 Предполагаемые рабочие отношения между группами Члены каждой команды Команды Большие требования Требуются усилия Рабочая группа 1 XXX Команда 2 XXXX Команда 3 XX X Команда 4 X XX Команда 5 X [27] Международное общество клинической денситометрии, Официальные позиции ISCD для взрослых, 2015 г., http: // www .iscd.org/official-positions/2015-iscd-official-positions-adult. Клиническое использование количественной компьютерной томографии и периферической количественной компьютерной томографии в лечении остеопороза у взрослых: официальные положения ISCD 2007 г.
Радиомика на основе компьютерной томографии расшифровывает прогностические и молекулярные различия в интерстициальных заболеваниях легких, связанных с системным склерозом.
Abstract
Предпосылки Радиомные характеристики, вычисленные на основе обычных медицинских изображений, демонстрируют большой потенциал персонализированной медицины при раке.Пациенты с системным склерозом (SSc), редким полиорганным аутоиммунным заболеванием, имеют такой же плохой прогноз из-за интерстициальной болезни легких (ILD).
Цели Изучить анализ многомерных изображений (радиомика) на основе компьютерной томографии (КТ) для характеристики заболевания, стратификации риска и передачи информации о патофизиологии легких при СС-ВЗЛ.
Методы Мы исследовали две независимые когорты SSc-ILD с проспективным наблюдением (Цюрих, исходная когорта, n = 90; Осло, валидационная когорта, n = 66).Для каждого пациента мы определили 1’355 устойчивых радиомных признаков на основе стандартных изображений компьютерной томографии. Мы выполнили неконтролируемую кластеризацию, чтобы идентифицировать и охарактеризовать кластеры пациентов на основе изображений. Клинически применимая прогностическая количественная оценка радиомного риска (qRISSc) для выживаемости без прогрессирования заболевания была получена из радиомных профилей с использованием контролируемого анализа. Биологическая основа qRISSc была оценена с применением межвидового подхода путем корреляции с данными протеомики легких, гистологическими данными и данными экспрессии генов, полученными у мышей с фиброзом легких, индуцированным блеомицином.
Результаты Рентгенологическое профилирование позволило идентифицировать две клинически и прогностически различные группы пациентов с СС-ВЗЛ. Чтобы оценить клиническую применимость, мы получили и проверили извне бинарную количественную оценку радиомного риска, состоящую из 26 характеристик, qRISSc, которая точно предсказывала выживаемость без прогрессирования заболевания и значительно улучшала параметры стратификации клинического риска в многомерных регрессионных анализах Кокса в объединенных когортах. Высокий показатель qRISSc, который определяет пациентов с риском прогрессирования, был обратным переводом с человека на экспериментальный ILD и коррелировал с активацией фиброзного пути.
Выводы Стратификация риска на основе радиомики с использованием рутинных компьютерных томографов обеспечивает дополнительную фенотипическую, клиническую и прогностическую информацию, значительно влияющую на принятие клинических решений при СС-ВЗЛ.
Сноски
Эта рукопись недавно была принята к публикации в European Respiratory Journal . Он публикуется здесь в принятой форме перед копированием и набором нашей производственной группой. После того, как эти производственные процессы будут завершены и авторы утвердят полученные доказательства, статья переместится в последний выпуск ERJ в Интернете.Пожалуйста, откройте или загрузите PDF-файл, чтобы просмотреть эту статью.
Конфликт интересов: доктор Шниринг сообщает о грантах от Forschungskredit PostDoc из Цюрихского университета во время проведения исследования; .
Конфликт интересов: доктору Мацюкевичу нечего раскрывать.
Конфликт интересов: доктору Габрису нечего раскрывать.
Конфликт интересов: доктору Бруннеру нечего раскрывать.
Конфликт интересов: доктору Блотгену нечего раскрывать.
Конфликт интересов: д-р Мейер сообщает о грантах от Bangerter Foundation и Швейцарской академии медицинских наук во время проведения исследования; .
Конфликт интересов: д-ру Брага-Лагаш нечего раскрывать.
Конфликт интересов: доктору Улдри нечего раскрывать.
Конфликт интересов: доктору Хеллеру нечего раскрывать.
Конфликт интересов: доктору Гукенбергеру нечего раскрывать.
Конфликт интересов: д-р Фретхейм сообщает о других от Actelion, других от GSK, других от Bayer, помимо представленных работ; .
Конфликт интересов: доктору Накасу нечего раскрывать.
Конфликт интересов: д-р Хоффманн-Фольд сообщает о грантах и личных гонорарах от Boehringer-Ingelheim, личных гонорарах от Roche, личных гонорарах от Actelion, личных гонорарах от Bayer, помимо представленных работ; .
Конфликт интересов: д-р Дистлер сообщает о грантах и других услугах от Abbvie, Actelion, Acceleron Pharma, Amgen, AnaMar, Baecon Discovery, Blade Therapeutics, Bayer, Boehringer Ingelheim, Catenion, Competitive Drug Development International Ltd, CSL Behring, ChemomAb, Curzion Pharmaceuticals, Ergonex, Galapagos NV, Glenmark Pharmaceuticals, GSK, Inventiva, Italfarmaco, iQone, iQvia, Lilly, medac, Medscape, Mitsubishi Tanabe Pharma, MSD, Novartis, Pfizer, Roche, Sanofi, Target Bio Science и UCB, за пределами представленных работ ; Кроме того, Dr.Дистлер имеет патент МИР-29 для лечения системного склероза.
Конфликт интересов: доктору Фрауэнфельдеру нечего раскрывать.
Конфликт интересов: д-ру Танадини-Ланг нечего раскрывать.
Конфликт интересов: д-р Маурер сообщает о грантах Фонда Гебауэра, грантах Фонда Люнге Цюриха, грантах Фонда ОПО, грантах Фонда профессора Макса Клотты во время проведения исследования; гранты от AbbVie, гранты от Protagen, гранты от Novartis Biomedical Research, другие от Boehringer-Ingelheim, другие от Pfizer, другие от Roche, другие от Actelion, другие от MSD, помимо представленных работ; Кроме того, Dr.У Maurer есть патент МИР-29 для лечения системного склероза.
Получено 12 декабря 2020 г.
Принято 23 сентября 2021 г.
Авторские права © Авторы 2021. Для получения прав на воспроизведение и разрешений обращайтесь в permissions {at} ersnet.